Lalat yang tak terlihat: metode baru untuk mempelajari sistem saraf melalui depigmentasi jaringan

Studi tentang suatu organisme adalah proses yang kompleks dan membutuhkan akurasi. Metode pemindaian modern telah berhasil dalam hal ini. Hari ini kita dapat mempelajari tubuh atau organ individual secara detail dalam gambar tiga dimensi. Sekitar 100 tahun yang lalu, pandangan organ tiga dimensi hanya dapat diperoleh dengan mengeluarkannya dari tubuh dan memeriksanya hidup, sehingga bisa dikatakan. Namun, selalu ada beberapa "tetapi". Tetapi bahkan pemindai dan mikroskop yang paling akurat tidak dapat memberikan akurasi 100%. Sekarang, jika mungkin untuk membuat segala sesuatu yang tidak perlu tidak terlihat, dan biarkan bagian tubuh yang ingin kita pelajari terlihat. Kedengarannya seperti fiksi ilmiah, bukan? Saya setuju. Tapi sekarang ini nyata. Hari ini kita akan mengenal studi tentang metode baru untuk memindai organisme menggunakan contoh Drosophila. Bagaimana para ilmuwan berhasil membuat buah midge biasa "tidak terlihat", seberapa akurat metode pemindaian mereka dan bagaimana ini akan membantu dalam diagnosis penyakit manusia? Jawaban atas pertanyaan-pertanyaan ini dan lainnya hanya bisa kita dapatkan di laporan para peneliti. Jadi, jangan menariknya. Ayo pergi.

Dasar studi

Seperti yang saya katakan di salah satu artikel sebelumnya , karakter utama yang, seperti hari ini, adalah Drosophila, serangga kecil ini dan, sebenarnya, serangga yang mengganggu adalah subjek dari banyak penelitian. Dengan bantuannya, para ilmuwan mempelajari cukup banyak hal: dari aerodinamika hingga sistem saraf. Dan itu tentang yang terakhir yang akan dibahas hari ini. Studi tentang sistem yang sedemikian kompleks pada organisme kecil semacam itu sarat dengan kesulitan tertentu. Kita sudah terbiasa dengan metode mempelajari organisme dengan memotongnya menjadi banyak lapisan ultrathin. Metode ini memungkinkan untuk mempelajari banyak sistem secara lebih rinci. Namun, mengenai sistem saraf, metode ini, menurut para peneliti, melanggar integritas seluler, yang mempersulit proses mempelajari bagian-bagian individual dari sistem.



Jika kami menerapkan pemindaian pada organisme kecil tanpa “pelapisan” fisik, kami akan melihat semua sistem secara bersamaan. Tetapi para ilmuwan ingin mempelajari hanya satu sistem, sementara yang lain tidak boleh mengganggu proses ini. Oleh karena itu, mereka datang dengan ide cemerlang dan sederhana - untuk membuat semuanya tidak terlihat (atau lebih transparan), dan membiarkan sistem yang diperlukan tidak tersentuh.

Pada saat ini, ada cukup alat untuk mengimplementasikan ide semacam itu, hanya tinggal menggabungkannya saja. Bahan utama dari metode pemindaian baru yang disebut FlyClear (untuk menghormati subjek uji pertama - Lalat Drosophila) adalah "pembersihan" jaringan dan ultramroskopi.



Drosophila dipilih sebagai subjek ujian karena suatu alasan. Dasar dari sebagian besar metode pembersihan jaringan adalah modifikasi genetik dari organisme uji. Dalam hal ini, itu adalah fluoresensi. Proses ini sangat kompleks dan memakan waktu. Semakin besar bodi, semakin banyak waktu yang dihabiskan untuk modifikasi. Selain itu, tidak semua makhluk dapat dimodifikasi dengan cara yang diinginkan para ilmuwan. Drosophila cocok untuk manipulasi genetik serupa dengan cukup mudah, dan proses ini tidak memakan banyak waktu.

Saat ini, metode yang paling populer untuk mempelajari organisme adalah mikroskopi confocal, tetapi dilakukan hanya setelah diseksi jaringan. Muncul pertanyaan - dan jika tidak membedah? Dalam hal ini, kami mendapatkan gambar pucat berkualitas rendah, dan prosesnya sendiri akan membutuhkan banyak waktu. Penyerapan yang kuat dan hamburan foton dalam sampel juga akan diamati, terutama dengan peningkatan pigmentasi jaringan (seperti pada Drosophila). Oleh karena itu, sampel harus dibersihkan, yaitu dibuat transparan. Dengan demikian, untuk meratakan penurunan intensitas sinyal dan mencapai resolusi spasial yang seragam. Cara utama untuk "buram" (permisi untuk kata fiktif) jaringan adalah untuk mengurangi indeks bias pada batas antara komponen seluler.

Para peneliti tidak menyangkal bahwa sekarang ada beberapa cara yang sudah menjadi klasik untuk membuat kain transparan. Namun, mereka juga mengklaim bahwa metode ini memiliki sejumlah kelemahan. Pelestarian morfologi, stabilitas fluoresensi, kedalaman pemindaian dan sebagainya - dengan semua aspek ini, metode yang ada, dengan kata lain, tidak apa-apa. Selain itu, tidak satu pun dari mereka memberikan depigmentasi jaringan yang lengkap.

Ternyata untuk pemindaian tubuh kecil yang lebih baik masih perlu melakukan penampang jaringan? Tidak juga. Para ilmuwan mengutip Drosophila yang sama sebagai contoh. Terletak di daerah periferal (kaki, mata, antena), neuron sensorik Drosophila memiliki koneksi yang sangat panjang dengan banyak saraf dan dengan otak. Jika wilayah ini berlapis, maka kita tidak akan mendapatkan gambaran lengkap tentang bagaimana sistem saraf terstruktur di wilayah ini.

Dalam penelitian ini, metode FlyClear memungkinkan kami untuk menghilangkan pigmentasi jaringan Drosophila, memperlihatkan sistem sarafnya. Butuh sekitar sebulan. Dan ultramicroscopy memungkinkan kami untuk memvisualisasikan koneksi saraf terkecil dan membangun peta lengkap sistem saraf midge. Suatu zat juga memainkan peran besar, dengan bantuan yang memungkinkan untuk "mewarnai" sistem saraf dalam warna hijau terang - protein fluorescent hijau (selanjutnya disebut ZFB). Gen untuk protein ini, diperoleh dari ubur-ubur Aequorea victoria, digunakan tepat untuk modifikasi gen sampel uji.


Ubur-ubur Aequorea victoria.

Data yang diperoleh dengan mikroskop fluoresensi diproses oleh algoritma khusus yang memungkinkan Anda membuat gambar tiga dimensi dengan resolusi tinggi.

Persiapan belajar

Pembersihan optik jaringan Drosophila bukanlah proses yang mudah. Exoskeleton Chitoskeletal dan fotopigmen mata facet adalah daerah yang paling sulit dari tubuh midge untuk prosedur ini. Saat ini metode pembersihan jaringan yang tersedia jauh dari ideal, karena para peneliti membuat sendiri - FlyClear, yang saya sebutkan sebelumnya.

FlyClear menggabungkan beberapa metode sebelumnya. Yang pertama dalam proses ini adalah CUBIC (koktail pencitraan otak yang jernih dan tidak terhalang). Langkah selanjutnya tergantung pada keadaan sampel (larva atau dewasa).


Opsi untuk prosedur FlyClear.

Dalam kasus larva, protease 0,03% dan fiksasi formaldehida digunakan. Faktanya adalah bahwa protease memecah ikatan peptida antara asam amino protein, dan ini membantu untuk "menghitamkan" jaringan. Selanjutnya, aseton digunakan pada sampel untuk permeabilisasi (perubahan permeabilitas membran sel).

Para ilmuwan berhasil meningkatkan tahap CUBIC dengan mengganti [CH ₃ CH (OH) CH ₂ ] ₂ NCH ₂ CH ₂ N [CH ₂ CH (OH) CH ₃ ] ₂ (N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ) ethylenediamine) pada C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ (2.2 ', 2 ", 2"' - (ethylene dinitrile) tetraethanol)). Perubahan ini memungkinkan untuk mencapai depigmentasi lengkap jaringan, termasuk di daerah kompleks (mata dan epidermis).

Jadi, metode depigmentasi jaringan lengkap berfungsi. Sekarang Anda perlu memeriksa tahap penting kedua dari studi ini - fluoresensi. Lebih tepatnya, perlu untuk memeriksa apakah reagen baru C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O _{4 akan} menekan sinyal fluoresensi, mengingat Drosophila sudah memiliki fluoresensi rendah setelah manipulasi genetik. Untuk tes, sampel (tubuh Drosophila) dibagi dua: satu setengah tidak diobati, yang kedua dengan pengobatan. Analisis menunjukkan bahwa tingkat keparahan ZFB benar-benar menurun ketika menggunakan C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ , tetapi ini tidak mempengaruhi akurasi keseluruhan. Dan semua berkat fakta bahwa reagen yang sama memungkinkan untuk mencapai tingkat depigmentasi jaringan yang tinggi. Yaitu, keuntungan dari pereaksi tersebut menunjukkan kelemahannya.

Sampel jadi harus dipertimbangkan, sehingga untuk berbicara, dan untuk ini, ultramicroscopy canggih digunakan untuk mendapatkan gambar sampel dengan resolusi yang sama di semua pesawat.


Sistem optik: 1 dan 3 - lensa silinder asferis plano-cembung; 2 - lensa Powell; 4 - aperture lembut apodizing elips; 5 dan 6 - lensa silinder.

Biasanya, ultramicroscopy standar menggunakan lensa silindris dan bukaan persegi panjang. Dalam penelitian ini, komponen tambahan digunakan yang mengubah bentuk balok menjadi ultra tipis dengan karakteristik yang ditingkatkan.

Penggunaan lensa bola disebabkan kemampuan untuk mendapatkan gambar tanpa distorsi dan dengan sedikit penyimpangan.

Bukaan standar juga telah diubah menjadi bukaan lembut apodizing elips (pada gambar di atas pada nomor 4). Bukaan baru menghilangkan distribusi intensitas yang tidak diinginkan dalam sistem optik.

Hasil penelitian

Di bawah ini adalah sistem spesifik dari organisme Drosophila (pernapasan, visual, saraf, dll.) Yang disorot oleh ZFB, sementara sisa jaringan benar-benar mengalami depigmentasi.

Agar tidak meregangkan artikel, saya menyembunyikan semuanya di bawah spoiler.









Para ilmuwan tanpa ragu menyebut pencapaian terbesar dari penelitian mereka kemampuan untuk membuat peta tiga dimensi penuh dari sistem saraf. Dan jika Anda menganggap bahwa sistem ini milik organisme sekecil itu (Drosophila), maka pencapaian ini menjadi lebih signifikan.

Teknik baru ini memungkinkan Anda untuk menentukan secara akurat di mana dan bagaimana neuron-neuron ini atau lainnya saling terhubung, baik di antara mereka maupun dengan otak. Jika penampang digunakan, ini tidak akan mungkin terjadi.



Sebagai peragaan kemampuan metode mereka, para ilmuwan menunjukkan kepada kita dua jenis neuron sistem visual Drosophila: DCN - neuron klaster punggung dan MCN - neuron kolumnar otak (kolom korteks di bagian belakang otak). Di daerah dorsal-lateral otak, kluster DCN membentuk senyawa komisura untuk merangsang neuron sinaptik medula dan lobula di lobus optik. (gambar di atas a , c ).

Dalam gambar b dan d , hilangnya koneksi komisura pada mutan homozigot sel-sel saraf Neuroglian terlihat. Perubahan dalam sistem saraf ini terkait dengan proses pemurnian sel FlyClear.



Untuk membangun rekonstruksi tiga dimensi, gambar diambil dari dua arah ortogonal, yang kemudian digabungkan. Algoritma berbasis FFT 3D menentukan detail sampel yang terlihat lebih jelas di salah satu dari dua tumpukan gambar. Selanjutnya, semua ini digabungkan menjadi satu rekonstruksi tiga dimensi.

Mereka yang ingin membiasakan diri dengan studi ini secara lebih rinci dapat membaca laporan para ilmuwan dan bahan tambahan untuk itu.

Epilog

Para ilmuwan tidak sia-sia membual dan bangga dengan pekerjaan mereka, karena ini belum pernah terjadi sebelumnya. Metode pelapisan dengan penampang dominan di bidang penelitian tentang organisme. Tetapi metode ini, meskipun memiliki banyak keuntungan, memiliki kerugian besar. Secara khusus, sayatan melanggar integritas seluler dan jaringan, sehingga mempersulit proses rekonstruksi sistem tubuh tertentu.

Menjelajahi organisme dengan sistem saraf yang kompleks, ketika setiap detail penting, kini akan jauh lebih mudah. Para ilmuwan akan dapat memperoleh lebih banyak data, yang akan memungkinkan mereka untuk mendeskripsikan lebih detail proses-proses lain di dalam tubuh.

Juga, jangan lupa bahwa Drosophila hanya eksperimental dalam penelitian ini, dan bukan dasarnya. Meningkatkan metode pemindaian baru juga dapat melayani orang tersebut. Dan tidak hanya untuk mempelajari tubuh dan unsur-unsur penyusunnya, tetapi juga untuk mendiagnosis penyakit yang dapat disembunyikan pada tahap awal di mana metode pemindaian yang tersedia saat ini tidak dapat menentukannya.

Penelitian membuka banyak hal baru: spesies hewan baru, zat baru, proses, dan fenomena. Tetapi tanpa penelitian yang bertujuan untuk menciptakan alat penelitian, semua ini tidak mungkin terjadi.


Terima kasih telah tinggal bersama kami. Apakah Anda suka artikel kami? Ingin melihat materi yang lebih menarik? Dukung kami dengan melakukan pemesanan atau merekomendasikannya kepada teman-teman Anda, diskon 30% untuk pengguna Habr pada analog unik dari server entry-level yang kami buat untuk Anda: Seluruh kebenaran tentang VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps dari $ 20 atau bagaimana membagi server? (opsi tersedia dengan RAID1 dan RAID10, hingga 24 core dan hingga 40GB DDR4).

VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps hingga 1 Januari gratis jika dibayar untuk jangka waktu enam bulan, Anda dapat memesan di sini .

Dell R730xd 2 kali lebih murah? Hanya kami yang memiliki 2 x Intel Dodeca-Core Xeon E5-2650v4 128GB DDR4 6x480GB SSD 1Gbps 100 TV dari $ 249 di Belanda dan Amerika Serikat! Baca tentang Cara Membangun Infrastruktur Bldg. kelas menggunakan server Dell R730xd E5-2650 v4 seharga 9.000 euro untuk satu sen?