Pada pertengahan 2018,
karya tentang elektrofisiologi otak tikus
diterbitkan , bersama dengan mana satu
set data unik dibuat tersedia untuk umum. Dataset unik karena berisi rekaman simultan dari potensi bidang lokal menggunakan elektroda
Neuropixel baru yang padat (probe, atau probe) dan elektroda tambalan dari sel yang terletak di dekat sampel. Ketertarikan pada rekaman tersebut tidak hanya mendasar, tetapi juga diterapkan, karena memungkinkan Anda untuk memvalidasi model untuk analisis aktivitas saraf yang direkam oleh sampel modern. Dan ini, pada gilirannya, secara langsung berkaitan dengan pengembangan protesa neuro baru. Apa hal baru yang mendasar, dan mengapa dataset ini sangat penting - saya akan memberitahu Anda di bawah potongan.
KDPV: hasil pemodelan potensi ekstraseluler dekat satu neuron selama generasi potensial aksi ( sumber ). Warnanya menunjukkan amplitudo potensial. Ilustrasi ini akan penting untuk pemahaman lebih lanjut.Metode elektrofisiologis untuk mempelajari otak didasarkan pada pencatatan potensi listrik otak. Mereka dapat dibagi menjadi non-invasif - terutama elektroensefalografi (EEG) - dan invasif, misalnya, elektrokortikografi (EKG), klem-klem (klem-klem) atau pendaftaran potensi lapangan lokal (LPP = potensi lapangan lokal, LFP) . Untuk yang terakhir, elektroda kecil berukuran 10-100 mikron disuntikkan langsung ke otak dan potensinya dicatat. Untuk mempelajari aktivitas otak mamalia di tingkat sel, yaitu untuk mengukur aktivitas sel individu, metode non-invasif yang tersedia tidak dapat diterapkan, karena potensi dari satu sel meluruh di ruang dengan sangat cepat, secara harfiah untuk 100 μm (lihat KDPV). Oleh karena itu, dalam setiap model hewan, serta pada manusia, metode non-invasif memberikan informasi hanya pada aktivitas kolektif neuron dan kerja, kemungkinan besar, pada tingkat jaringan, tetapi tidak pada neuron individu.
Tetapi dengan metode invasif tidak begitu sederhana. Untuk mendaftarkan aktivitas satu neuron, perlu membawa elektroda sangat dekat ke neuron, idealnya menempatkannya di dalam sel, seperti yang dilakukan pada penjepit tempel, atau menggunakan
elektroda tajam , yang sulit dalam praktiknya, sangat sulit. Di sisi lain, setiap elektroda ekstraseluler ~ 10 μm dalam ukuran akan mencatat potensial aksi dari 5-10 sel di sekitar karena tingginya kepadatan neuron dan konduktivitas ionik yang tinggi dari larutan ekstraseluler. Oleh karena itu, tugas mendaftarkan sel individu secara teknis diselesaikan dengan meningkatkan kepadatan elektroda yang terletak di dekat sel. Dalam hal ini, elektrofisiologi modern sedang bergerak menuju peningkatan kepadatan elektroda, peningkatan jumlah mereka dan penurunan ukuran. Di antara persyaratan ada kebutuhan untuk memperkuat sinyal lebih dekat ke situs pendaftaran untuk mengurangi kebisingan, dan menempatkan multiplexer untuk mengurangi ukuran. Jadi, pada 2016, diumumkan dalam pracetak, dan pada 2017 diterbitkan di Nature, dan pada 2018 sudah muncul
di pasaran , sampel baru Neuropixel densitas tinggi yang dibuat oleh teknologi CMOS, pada 960 elektroda, di mana ada 384 yang tersedia untuk perekaman simultan. Ukuran satu situs pendaftaran adalah 12 mikron. Ketebalan sampel adalah 24 mikron. Selain itu, dengan elektroda densitas tinggi, serta dengan amplifikasi aktif, orang-orang mulai bekerja untuk waktu yang lama, tetapi Neuropixels adalah yang pertama untuk mencapai produksi dan penjualan, jadi dalam waktu dekat ini pengujian khusus dalam artikel akan semakin sering.
Fig. Skema neuropixels. Pada substrat silikon monolitik terdapat 960 situs, serta antarmuka multiplekser dan AD penuh untuk 384 saluran.Struktur data
Selain
ritme aktivitas klasik (alfa, beta, gamma, dll.) Yang bertanggung jawab untuk sinkronisasi kelompok, data yang diperoleh dengan menggunakan sampel tersebut juga mengandung potensi aksi sel individual (AP = potensial aksi, AP, paku aksi, adhesi) , yang pada catatan terlihat seperti puncak pendek dengan durasi ~ 1 ms.
Fig. Sinyal Neuropixels. Dua bagian dari sinyal dibedakan: potensi medan lokal (LFP, hingga ~ 300 Hz) dan aktivitas seluler (AP, dari 300 Hz).Pada saat yang sama, jika potensi medan lokal frekuensi rendah biasanya dianalisis dalam kerangka osilasi dan analisis spektral atau wavelet digunakan seperti dalam EEG, maka aktivitas seluler berisi potensi aksi sel individu, terdiri dari peristiwa terpisah dengan latar belakang kebisingan. Tugas mengisolasi aktivitas masing-masing sel secara formal direduksi menjadi tugas masalah pesta koktail, ketika seorang pembicara terpisah harus dibedakan dari perangkat pembicara. Data besar muncul ketika kami mengevaluasi aliran data dari satu sampel tersebut. Untuk analisis paku, pengambilan sampel dilakukan pada 30-40 kHz dengan digitalisasi dari 16 bit per titik (uint16), sehingga, perekaman 100 elektroda dalam 1 detik akan berbobot dari 8 MB. Pada saat yang sama, eksperimen biasanya berlangsung berjam-jam, yang jumlahnya mencapai ratusan gigabyte hanya dari satu hari kerja, dan untuk studi penuh, katakanlah, dari 10 catatan tersebut. Oleh karena itu, potensi sampel ini juga sangat tergantung pada algoritma pembelajaran mesin, yang digunakan untuk analisis data.
Pembelajaran Mesin dan Aktivitas Seluler
Biasanya, pipa untuk analisis aktivitas sel terdiri dari preprocessing, segmentasi spike, dan clustering. Bagian dari penelitian ini biasa disebut sebagai analisis klaster atau spike sorting. Sebagai preprocessing, low-pass filtering (> 300 Hz) biasanya digunakan, karena diyakini bahwa tidak ada ritme fisiologis lain di atas 300 Hz, dan hanya informasi tentang aktivitas seluler individu tetap. Juga, selama preprocessing dalam sampel padat, dimungkinkan untuk mengurangi noise yang berkorelasi, misalnya, pickup pada 50 Hz. Segmentasi paling sering diambil sebagai ambang batas sederhana, misalnya, apa pun di atas 5 standar deviasi kebisingan dapat dianggap sebagai peristiwa. Terjadi bahwa segmentasi dua-ambang digunakan, dengan ambang lunak dan keras, untuk membedakan peristiwa terkait dalam ruang dan waktu, seperti dalam algoritma
segmentasi daerah aliran sungai, hanya dalam klaster pengelompokan distribusi penanda yang memperhitungkan topologi sampel. Setelah segmentasi, jendela yang berlangsung 1-2 ms diambil di dekat pusat setiap peristiwa, dan sinyal di jendela ini, dikumpulkan dari semua saluran, menjadi sampel untuk pengelompokan lebih lanjut. Sampel ini disebut gelombang lonjakan. Sel yang berbeda dan jaraknya yang berbeda dari situs pendaftaran mengarah pada fakta bahwa bentuk gelombang mereka akan bervariasi (lihat KDPV). Algoritma pengelompokan bentuk gelombang itu sendiri menggunakan EM, pencarian kecocokan templat, pembelajaran mendalam dan banyak variasi (
topik pada github ). Satu-satunya persyaratan adalah pelatihan tanpa guru. Tapi ada satu masalah. Tidak ada yang tahu pasti parameter apa yang perlu Anda ambil untuk pipa Anda sehingga analisis adalah yang paling efektif. Biasanya, setelah pengelompokan, analis secara manual memeriksa hasil dan membuat perubahan sesuai kebijaksanaan. Dengan demikian, hasil analisis dapat mencakup kesalahan algoritma dan kesalahan manusia. Dan mereka mungkin tidak, oleh karena itu, masalah validasi obyektif tetap terbuka.
Ada beberapa cara untuk memvalidasi saluran pipa. Pertama, mengubah kondisi eksternal untuk objek studi. Misalnya, selama percobaan, jika Anda mempelajari bagian visual korteks, maka Anda dapat mengubah tekstur, warna, dan kecerahan gambar. Jika dalam analisis ada sel yang mengubah aktivitasnya tergantung pada rangsangan, maka Anda beruntung. Kedua, Anda dapat secara farmakologis meningkatkan atau mengurangi aktivitas jenis sel tertentu, misalnya, menggunakan penghambat saluran tertentu. Maka aktivitas sel Anda akan meningkat / menurun, dan Anda akan melihat perbedaan dalam pengelompokan. Namun, modulasi aktivitas semacam itu juga akan mengarah pada perubahan bentuk gelombang, karena profil potensial aksi dalam waktu sepenuhnya ditentukan oleh kinetika saluran ion. Ketiga, Anda bisa mengukur atau menginduksi aktivitas sel tertentu secara optogenetik atau menggunakan pipet tambalan, seperti dalam dataset ini. Karena rasio signal-to-noise yang besar dan stabilitas elektroda tambalan, Anda akan sepenuhnya percaya diri dalam aktivitas sel tunggal. Secara konseptual, publikasi ini didedikasikan untuk perakitan dataset yang valid menggunakan penjepit tambalan.
Fig. Representasi skematis dari posisi relatif sampel (garis AB) dan pipet tambalan (garis C'CT) di daerah korteks tikus, yang bertanggung jawab untuk memproses informasi sensorik dari forepaw (S1FL = sensory cortex 1 forelimb.Tak perlu dikatakan, pekerjaan metodologis sangat sulit, karena para peneliti harus mengembangkan metode untuk penentuan posisi relatif dua elektroda di korteks serebral tanpa kontrol visual dengan akurasi ~ 10 μm.
Efek kepadatan elektroda pada pengelompokan spike
Mengapa begitu penting untuk meningkatkan kepadatan situs pendaftaran? Untuk analogi, kami mengambil fakta yang diketahui di antara para peneliti EEG bahwa, dari ambang tertentu, peningkatan jumlah elektroda di tutup tidak menyebabkan peningkatan nyata dalam informasi yang diterima, yaitu, sinyal dari elektroda sedikit berbeda dari interpolasi linier sinyal dari elektroda tetangga. Seseorang mengatakan bahwa ambang ini sudah mencapai 30, seseorang di 50, seseorang di 100 elektroda. Mereka yang bekerja dengan EEG secara rinci dapat diperbaiki. Tetapi dalam kasus aktivitas seluler, ambang untuk kepadatan situs pendaftaran pada satu sampel belum diketahui, sehingga ras sampel kepadatan tinggi terus berlanjut. Untuk ini, tim Lab Lab terus bekerja dengan sampel dengan situs 5x5 μm
2 , dan
data awal telah diposting untuk ini. Spesialis yang bekerja dengan elektroda padat berbagi pengalaman mereka bahwa, secara tak terduga, jumlah spesifik sel individu yang dapat diisolasi dari sampel dari area yang sama lebih tinggi di mana kepadatan situs pendaftaran lebih tinggi. Efek ini diilustrasikan dengan baik dalam
penelitian lain oleh rekan penulis yang sama, yang secara artifisial hanya memilih sebagian situs dari sampel padat dan secara visual mengevaluasi kualitas cluster yang dihasilkan setelah konversi tSNE ke nilai PCA dari nilai gelombang dari lonjakan gelombang. Ini bukan kanon untuk pengelompokan, tetapi bagus untuk menggambarkan dependensi. Sebagai tes, Neuroseeker bertindak pada 128 saluran dengan ukuran total 700x70 μm
2 dengan situs 20x20 μm
2 .
Fig. TSNE di atas diagram PCA pada bentuk gelombang mentah sementara secara artifisial mengurangi kepadatan situs pada sampel. Situs kerja ditampilkan secara skematis di atas setiap diagram. Jelas ditunjukkan bagaimana jumlah cluster terpisah tumbuh dengan meningkatnya kepadatan situs, A adalah yang terbaik, F adalah yang terburuk.Apa esensi dari pekerjaan itu
Dalam data Marques-Smith et al. ada rekaman simultan dari klem dan sampel tambalan. Menggunakan data patchclamp, para ilmuwan menemukan momen-momen aksi potensial dan menggunakan momen-momen ini untuk mengelompokkan dan membentuk gelombang rata-rata pada sampel. Hasilnya, mereka mampu membangun distribusi yang sangat tinggi dari potensi aksi dalam ruang dan waktu di seluruh area sampel.
Fig. Di sebelah kiri, jejak aktivitas sel ditampilkan secara bersamaan di klip tambalan (hitam) dan pada saluran Neuropixels terdekat (biru). Di tengah - 500 sampel individu dan rata-rata mereka. Di sebelah kanan adalah distribusi potensial aksi di ruang atas area sampel dan dalam waktu.Selanjutnya, muncul pertanyaan tentang variasi bentuk gelombang ekstraseluler dari spike ke spike - ya, itu bisa diraba dan harus diperhitungkan. Kemudian mereka menunjukkan bahwa pada dasarnya mungkin untuk melacak distribusi potensial aksi di sepanjang membran sel menggunakan elektroda padat mereka, tetapi ini telah ditunjukkan sebelumnya dalam karya kelompok lain. Sebagai kesimpulan, mereka menawarkan kolaborator potensial beberapa pertanyaan mendasar dari neurofisiologi, yang dapat Anda coba jawab dengan bantuan dataset mereka, dan juga menawarkan untuk menggunakan dataset untuk memvalidasi pipa untuk mengelompokkan aktivitas sel. Yang terakhir terdengar seperti tantangan yang berani, karena ada banyak algoritma pengelompokan sekarang, dan persaingan di antara metode sangat besar. Tidak setiap metode, pertama, bekerja dengan sejumlah besar saluran, dan, kedua, tidak semua orang dapat memberikan pengelompokan berkualitas tinggi yang objektif.
Apa selanjutnya
Pertama, versi baru
Neuroseeker pada 1300 saluran yang juga menggunakan teknologi CMOS semakin dekat, data awal
sudah tersedia .
Kedua, kami sedang menunggu dataset lain, sudah dari Institut Allen untuk Ilmu Otak, yang diumumkan pada konferensi FENS pada tahun 2018. Ini akan secara bersamaan menggunakan 4 (!) Sampel Neuropixels untuk mempelajari bagian visual dari korteks tikus dengan berbagai rangsangan visual. Mereka berjanji untuk menerbitkan pada akhir 2018 di
sini , di sebelah data biphoton (juga dataset yang sangat kuat), tetapi sejauh ini tidak ada.
Ketiga, tugas pengelompokan sel dari perekaman potensi ekstraseluler tampaknya indah secara estetika bagi saya. Ini memadukan metode mikroelektronika, neurofisiologi, dan pembelajaran mesin. Selain itu, ia memiliki nilai fundamental dan terapan yang bagus. Saya kira para pendengar habr akan tertarik untuk belajar tentang masakan teknis elektrofisiologi, yaitu, tentang algoritma pengelompokan, karena di daerah ini telah mengembangkan kebun binatang sendiri. Saya, pada gilirannya, telah mengumpulkan beberapa pertanyaan untuk algoritma ini, dan dataset seperti itu tidak dapat dilewati. Oleh karena itu, pada bagian selanjutnya, kita akan beralih ke analisis beberapa algoritma, dimulai dengan kanonis Klustakwik, dilanjutkan dengan metode templat Kilosort atau Spyking Circus, dan kemudian YASS, yang sangat kuat
menyatakan tentang dirinya sendiri bahwa ia bekerja lebih cepat dan lebih baik daripada semua orang lain, karena DL dan karena itu bisa. Topik di github dengan daftar beberapa clusterer di
sini . Mengantisipasi beberapa pertanyaan, saya tidak melihat titik mengembangkan algoritma saya sendiri, karena kompetisi sudah sangat besar, dan banyak ide telah diimplementasikan dan diuji oleh orang lain. Tetapi jika ada pemberani, saya akan berkontribusi dengan senang hati.
Saran dan keinginan diterima. Terima kasih atas perhatian anda!