Genetika dan ayam: protein CSF1-Fc manusia dalam protein telur

Alkisah hiduplah seorang kakek dan seorang wanita. Dan mereka punya ayam Ryaba. Ayam itu meletakkan testis, tapi bukan yang sederhana, tapi yang dimodifikasi secara genetis. Giliran yang tidak terduga, kan? Tetapi justru inilah yang akan dibahas hari ini. Obat-obatan telah banyak berubah selama puluhan tahun terakhir, atau bahkan ratusan tahun. Kami tidak lagi menggunakan lintah dan tidak menganggap lobotomi obat yang sangat baik untuk migrain. Sekarang ada banyak sekali obat yang dapat menyembuhkan berbagai macam penyakit. Dasar dari obat-obatan ini secara alami adalah senyawa kimia tertentu, yang produksinya kadang penuh dengan kesulitan besar. Dan kemudian para ilmuwan datang dengan ide cemerlang - mengapa kita membutuhkan semua bio-generator yang kompleks ini, jika Anda dapat menggunakan ayam. Ya, Anda dengar, ayamlah yang akan membawa telur yang mengandung senyawa kimia yang diperlukan, seperti protein. Bagaimana para ilmuwan mengubah ayam untuk mencapai tujuan-tujuan ini, apa yang datang darinya dan apakah kita tidak perlu takut menangkap planet ini dengan ayam betina yang termodifikasi secara karnivora dua meter, kita belajar dari laporan kelompok riset. Ayo pergi.

Dasar studi

Perlu dimulai dengan fakta bahwa penggunaan hewan sebagai bioreaktor bukanlah sesuatu yang baru dan revolusioner. Misalnya, Antithrombin III - obat yang diperoleh dari susu kambing hasil rekayasa genetika (GM) disetujui untuk digunakan pada tahun 2006. Dengan kata lain, kambing bertindak sebagai "laboratorium" penghasil susu, yang mencakup senyawa kimia yang digunakan dalam sediaan.

Namun, menurut para ilmuwan, penggunaan hewan besar untuk keperluan seperti itu cukup mahal, mengingat jumlah anak yang kecil, masa kehamilan yang panjang, dan kemudian tumbuh dewasa, dll. Itulah sebabnya mereka mengalihkan perhatian mereka pada ayam, dan juga karena fakta bahwa telur ayam mengandung jumlah protein yang cukup. Rata-rata 60 g telur ayam mengandung sekitar 3,5 gram protein. Dalam satu tahun, satu ayam bisa bertelur sekitar 300 telur. Kami menambahkan di sini pemeliharaan ayam yang murah dan pertumbuhan yang cepat dalam jumlah dalam kondisi normal.

Selain itu, selain keuntungan ekonomi, para ilmuwan mencatat lebih banyak manfaat ilmiah. Jadi, pada ayam dan manusia, pola glikosilasi, proses penambahan gula ke molekul organik, sangat dekat. Dan ini berarti bahwa akan ada imunogenisitas rendah dari persiapan protein telur yang membutuhkan glikosilasi untuk diaktifkan.

Semua ini terdengar sangat, sangat menarik, tetapi kita tahu bahwa sejauh ini telur ayam lebih banyak digunakan untuk telur dadar daripada sebagai sumber pangkalan obat. Artinya, ayam dalam penelitian ini tidak sederhana, (tidak, bukan emas, meskipun dari sudut pandang keuangan), dan dimodifikasi secara genetik.

Para ilmuwan mencatat bahwa sebelumnya, lentivirus digunakan untuk melakukan modifikasi gen ayam, karena mereka dengan sempurna mentransfer informasi genetik ke sel inang. Ekspresi transgen dapat dibatasi dalam saluran telur menggunakan urutan gen ovalbumin (albumin telur). Metode ini memungkinkan pembuatan dua protein aktif biologis dalam protein telur, namun, tingkat ekspresi secara signifikan kurang dari 1 g / l. Dan ini tidak cukup untuk teknik seperti itu menjadi menarik dari sudut pandang komersial dan industri.

Dalam studi ini, para ilmuwan memutuskan untuk menerapkan metode yang lebih maju dalam menghasilkan dua protein baru, termasuk dimer sitokin, serta metode pemurnian yang ditingkatkan. Interferon α2a, persiapan biologis yang dipatenkan untuk pengobatan beberapa jenis kanker dan hepatitis (sudah usang), digunakan sebagai model.

Partisipan utama dalam penelitian ini adalah faktor perangsang koloni makrofag (CSF1), yang merupakan bundel 4-heliks, yaitu secara struktural mirip dengan banyak sitokin, termasuk insulin, hormon pertumbuhan, laktogen plasenta, dll. "Produser" utama dalam penelitian ini adalah ayam. Hasil apa yang ditunjukkan oleh eksperimen dan kami akan pertimbangkan lebih lanjut.

Hasil penelitian


Gambar No. 1

0,5 kb (seribu pasang nukleotida / seribu basa berpasangan) dari urutan pengkodean α2a interferon disintesis dan dikloning ke dalam vektor lentiviral dari virus anemia infeksi menular kuda yang direplikasi-cacat-kuda dengan promotor EREOVA.

Untuk meningkatkan derajat ekspresi, 0,9 TPN dari urutan promotor ovalbumin ditambahkan antara elemen respons estrogen dan elemen pengatur yang bergantung pada steroid ( 1a ). Vektor lentiviral inilah yang memungkinkan untuk mendapatkan burung transgenik, di antaranya jantan (G1) terungkap, yang merupakan pembawa transgen utuh (utuh / utuh). Dengan demikian, dari jantan inilah jajaran burung transgenik (keturunan) pergi.

Melalui penggunaan antibodi yang merespon interferon manusia α, keberadaan interferon α2a dalam protein telur ayam uji ( 1b ) terdeteksi menggunakan protein immunoblot.

Immunoblot protein * adalah metode analitik untuk menentukan keberadaan protein dalam sampel.

Secara kuantitatif, α2a dijelaskan menggunakan uji immunosorbent terkait-enzim, ketika antibodi berikatan dengan antigen spesifik, yang memungkinkan untuk menentukan kuantitasnya.

Untuk mengkonfirmasi aktivitas biologis, sebelum proses pembersihan, para ilmuwan menempatkan putih telur yang diencerkan pada transfektor sel dengan gen reporter dari elemen respon yang dirangsang oleh interferon yang mengontrol ekspresi luciferase ( 1c ).

Gen reporter * - bergabung dengan sekuens pengatur gen lain untuk mempelajari manifestasi gen dalam kultur sel.

Luciferase * - enzim oksidatif yang memicu reaksi, salah satu fitur di antaranya adalah bioluminescence.

Setelah semua pemeriksaan, proses pembersihan dimulai, yang terdiri dari:

• klarifikasi ovomucin (glikoprotein dalam protein telur) dengan menurunkan pH;
• pengangkatan ovomusin menggunakan centrifuge;
• pemurnian interferon α2a menggunakan penangkapan HiTrap Blue dan kromatografi eksklusi ukuran lebih lanjut.

Tingkat pemurnian (> 95%) dikonfirmasi oleh elektroforesis protein dalam gel poliakrilamid ( 1d ).

Dimungkinkan untuk memperoleh 15 mg interferon α2a dari 100 ml protein telur, dan ini mewakili sekitar 60% volume interferon α2a (25 mg) yang terdeteksi oleh enzim immunoassay ( 1e ).

Anda mungkin memiliki pertanyaan - tetapi bagaimana dengan penyakit yang dapat melompat dari ayam ke manusia menggunakan α2a interferon ini. Para ilmuwan telah memeriksa ini, dan lebih tepatnya, sifat antivirus α2a dengan memasukkan virus tipe A H1N1 ke dalam sel yang sebelumnya diobati dengan α2a. Dan hasil analisis ini lebih dari positif ( 1f ) - aktivitas antivirus interferon dari protein telur adalah 1x10 ⁹ U / mg, yang merupakan urutan besarnya lebih tinggi daripada protein yang diproduksi bakteri.


Gambar No. 2

Salah satu protein terpenting dalam diferensiasi, proliferasi, dan berfungsinya makrofag adalah CSF1.

Urutan kode CSF1 babi, dikombinasikan dengan Fc, disintesis (pCSF1-Fc) dan dikloning ke vektor lentiviral pLenti6 (diisolasi dari HIV) antara promotor EREOVA2 dan elemen pengatur pasca transkripsi dari virus hepatitis kayu ( 2a ).

_Fc * (fragmen mengkristal imunoglobulin) adalah bagian dari molekul imunoglobulin yang berinteraksi dengan reseptor Fc pada permukaan sel dan dengan beberapa protein.

Setelah pemindahan jantan (G0), yang menjadi dasar garis keturunan baru, di antaranya transgen utuh terungkap dalam dua betina dan satu jantan. Individu-individu ini kemudian berpartisipasi dalam pemuliaan keturunan generasi berikutnya (G2). Elektroforesis protein gel poliakrilamid mengkonfirmasi keberadaan pCSF1-Fc dalam protein telur ( 2b ).

Babi CSF1 diekspresikan dalam sel Ba / F3. Ini mengarah pada fakta bahwa keberadaan sel-sel ini sangat tergantung pada CSF1-Fc. Dengan demikian, adalah mungkin untuk menilai kelayakan sel dari protein telur uji, yang cukup tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol (protein dari telur biasa), di mana tingkat kelangsungan hidup hampir nol ( 2c ).

Selanjutnya, protein telur dari pCSF1-F _dari telur dimurnikan dari ovomucin dan dipindahkan ke keadaan supernatan (supernatan, cairan di atas residu kering), seperti yang ditunjukkan pada gambar 2d .

Bentuk dimer aktif pCSF1-Fc dimurnikan dengan penggunaan MabSelect SuRe dan pemolesan lebih lanjut menggunakan kromatografi eksklusi ukuran ( 2e ). Tingkat kemurnian lebih dari 97%.

Hasilnya, berat molekul rata-rata sekitar 95,1 kDa (kilodalton), monodispersitas proteinnya juga memuaskan - Mw / Mn = 1,011 (Mw adalah berat molekul rata-rata berat, Mn adalah jumlah berat molekul rata-rata). Analisis model kopolimer menunjukkan adanya protein 85,6 kDa dan oligosakarida 9,5 kDa.

Kelayakan sel juga diuji - beberapa telur ditempatkan di lemari es pada -20 ° C selama 1 bulan, dan sebagian untuk periode yang sama, tetapi pada -80 ° C. Dalam kedua kasus, sel bertahan ( 2g ), yang menunjukkan kemungkinan penyimpanan jangka panjang dan penggunaan lebih lanjut bahkan sebelum pemurnian tanpa kehilangan aktivitas.

Analisis juga dibuat dari kemampuan protein yang dimurnikan untuk berinteraksi dengan reseptor CSF1. Ini dilakukan dengan menggunakan sel-sel sumsum tulang tikus, dan hasilnya memuaskan ( 2 jam ).


Gambar No. 3

Selanjutnya, para ilmuwan memutuskan untuk menguji aktivitas pCSF1-Fc dari protein telur dalam kondisi lapangan, yaitu, pada tikus laboratorium yang disuntikkan dengan 1 μg / g kontrol atau protein pCSF1-F murni. Setelah itu, berat dan histologi hati, limpa dan darah tikus diperiksa. Kedua varian pCSF1-Fc menyebabkan peningkatan jumlah sel F4 / 80 ⁺ CD11b ⁺ dalam darah ( 3a ) dan makrofag dari jaringan F4 / 80 ⁺ di hati ( 3b ). Peningkatan yang signifikan dalam berat hati dan limpa juga diamati ( 3c dan 3d ).


Gambar No. 4

Tes, analisis, dan eksperimen di atas menunjukkan hasil yang sangat baik. Sekarang tinggal membuktikan bahwa metode semacam itu dapat memungkinkan produksi sitokin manusia, yang dapat digunakan dalam obat-obatan.

Para ilmuwan mencatat bahwa pCSF1-Fc menunjukkan aktivitas yang baik dalam sel manusia dan dapat bersifat imunogenik. Untuk mengkonfirmasi ini, tikus laboratorium diimunisasi dengan protein CSF1-Fc untuk menghasilkan antibodi monoklonal yang bereaksi silang dengan CSF1 manusia.

Sebelum melakukan tes aktual dan menganalisis hasilnya, para ilmuwan menyiapkan ayam yang mengekspresikan protein CSF1-Fc manusia (hCSF1-F _c ). Untuk melakukan ini, kami menggunakan teknik dan sistem vektor yang dijelaskan sebelumnya. Pada dua ayam, transgen utuh terungkap yang menunjukkan ekspresi protein yang diperlukan 1 mg / ml ( 4a ). Diikuti oleh proses pembersihan di atas ( 4b ). Tingkat kelangsungan hidup hCSF1-Fc yang dimurnikan juga tinggi, bahkan setelah pengeringan vakum dan reduksi ( 4c ).

Untuk seorang kenalan yang lebih mendetail dengan nuansa penelitian, saya sangat menyarankan agar Anda melihat laporan para ilmuwan .

Epilog

Hasil penelitian ini adalah konfirmasi bahwa interferon α2a dan CSF1-Fc disintesis sempurna sebagai komponen putih telur biasa. Ekstraksi protein ini juga tidak memerlukan upaya khusus, tetapi hanya teknik kromatografi standar. Protein yang diperoleh aktif baik di laboratorium maupun di tubuh subjek yang hidup (tikus).

Banyak yang sangat skeptis terhadap modifikasi genetik. Beberapa bahkan takut akan frasa ini dan segala sesuatu yang dapat dihubungkan dengannya. Namun, hanya layak sedikit pemahaman tentang perspektif apa yang dapat diberikan modifikasi gen manusia, bagaimana ketakutan dan dogma usang dihilangkan. Dalam kasus khusus ini, kami meneliti sebuah studi di mana para ilmuwan benar-benar memaksa ayam untuk bertelur dengan protein manusia, yang dapat digunakan untuk membuat komponen yang diperlukan untuk membuat obat dengan murah, efisien dan cepat. Mungkin ayam-ayam ini tidak membawa telur emas, tetapi nilainya jauh lebih tinggi.



Terima kasih telah tinggal bersama kami. Apakah Anda suka artikel kami? Ingin melihat materi yang lebih menarik? Dukung kami dengan melakukan pemesanan atau merekomendasikannya kepada teman-teman Anda, diskon 30% untuk pengguna Habr pada analog unik dari server entry-level yang kami temukan untuk Anda: Seluruh kebenaran tentang VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps dari $ 20 atau bagaimana membagi server? (opsi tersedia dengan RAID1 dan RAID10, hingga 24 core dan hingga 40GB DDR4).

VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps hingga musim semi gratis ketika membayar selama setengah tahun, Anda dapat memesan di sini .

Dell R730xd 2 kali lebih murah? Hanya kami yang memiliki 2 x Intel Dodeca-Core Xeon E5-2650v4 128GB DDR4 6x480GB SSD 1Gbps 100 TV dari $ 249 di Belanda dan Amerika Serikat! Baca tentang Cara Membangun Infrastruktur Bldg. kelas menggunakan server Dell R730xd E5-2650 v4 seharga 9.000 euro untuk satu sen?