Membahayakan untuk kebaikan: Sistem kekebalan tubuh Lamprey dalam perang melawan kanker otak manusia

Otak kita adalah segalanya bagi kita. Pelanggaran terhadap pekerjaan organ penting ini menyebabkan konsekuensi yang mengerikan, dan terkadang fatal. Kompleksitas otak dan susunan sarafnya kolosal, yang sangat menyulitkan proses mengobati penyakit tertentu. Sebagai aturan, ketika kita merawat sesuatu, kita mencoba untuk menghilangkan cacat yang disebabkan oleh penyakit. Tapi, bagaimana jika cacat ini digunakan untuk memerangi apa yang membuatnya? Inilah tepatnya yang diputuskan untuk dilakukan oleh penulis penelitian yang kami pertimbangkan saat ini. Bagaimana para ilmuwan menerapkan gangguan penghalang darah-otak, mengapa kita membutuhkan akses ke matriks ekstraseluler otak, dan peran apa yang dimainkan parasit lamprey pada ikan? Laporan kelompok riset akan memberi tahu kami tentang hal ini. Ayo pergi.

Sedikit teori

Pertama-tama, ada baiknya memilah karakter dalam drama laboratorium ini.


Penghalang darah-otak

Salah satu peran utama dimainkan oleh sawar darah-otak (BBB) ​​- penghalang fisiologis antara sistem saraf pusat (SSP) dan sistem sirkulasi. Penghalang ini mencegah kontak jaringan saraf dengan berbagai komponen darah yang bersirkulasi, di antaranya mungkin ada racun, mikroorganisme, faktor seluler / humoral dari sistem kekebalan tubuh yang dapat merespons sel-sel otak sebagai benda asing. BBB dapat dibandingkan dengan bouncer di klub yang sangat mahal, membiarkan sistem saraf pusat secara eksklusif nutrisi. Tapi penjaga ini tidak terlalu pilih-pilih, dia sering tidak ketinggalan obat yang diperlukan untuk mengobati sistem saraf pusat. Ternyata suatu sistem yang ditujukan untuk manfaat kesehatan kita dapat menjadi penghalang bagi perawatannya. Inilah ironi dalam fisiologi.

Namun, penghalang darah-otak tidak selalu bekerja seperti arloji Swiss. Dalam kasus stroke, tumor, berbagai cedera kepala, penyakit kronis, BBB mulai gagal, yaitu membiarkan sistem saraf pusat seperti yang sebelumnya dihilangkan. Selain penyebab alami dari kegagalan, ada juga antropogenik: fokus USG intensitas tinggi dan agen osmotik yang mengganggu BBB. Mengapa merusak sesuatu yang memastikan fungsi normal otak, Anda bertanya. Kemudian, untuk memberikan obat yang akan disaring oleh BBB penuh. Pokoknya, penjaga tidak akan membiarkan dokter masuk ke klub untuk pengunjung yang pingsan, karena ia tidak memiliki kartu klub.

Yang utama dan umum untuk semua kasus, hasil gangguan BBB adalah paparan patologis dari matriks ekstraseluler (ECM) otak, yang diisolasi dalam kondisi normal.

Matriks ekstraseluler adalah dasar dari jaringan ikat yang menyediakan dukungan mekanis untuk sel dan transportasi bahan kimia.

Oleh karena itu, para ilmuwan percaya bahwa dengan menargetkan bagian-bagian tertentu dari otak dengan BBB yang terganggu secara patologis, adalah mungkin untuk mengirimkan obat-obatan ke bagian-bagian sistem saraf pusat yang rusak yang sebelumnya tidak dapat diakses justru karena BBB.

Dengan demikian, dimungkinkan untuk membuat ligan yang ditujukan untuk ECM, yang akan efektif dalam memerangi berbagai penyakit pada sistem saraf pusat, dan tidak dengan satu penyakit tertentu, seperti metode yang dikembangkan sebelumnya.

Untuk menguji teori ini dalam praktiknya, para ilmuwan memutuskan untuk menerapkan metode pemberian obat mereka pada glioblastoma yang tidak dapat disembuhkan (kanker otak). Jenis penyakit ini cukup langka, tetapi sangat sulit untuk dikalahkan. Bahkan setelah kemoterapi, terapi radiasi dan operasi, kelangsungan hidup sekitar 1-2 tahun.

Studi terbaru menunjukkan bahwa penggunaan imunoterapi melalui reseptor antigen chimeric berbasis interleukin-13 * * adalah pengobatan yang menjanjikan untuk glioblastoma.

Interleukin * adalah molekul informasi peptida yang diproduksi oleh leukosit, pada tingkat yang lebih rendah oleh fagosit dan jaringan lain. Interleukin adalah bagian dari sistem kekebalan tubuh.

Interleukin-13 * (IL13) adalah mediator utama dari perubahan fisiologis yang disebabkan oleh peradangan alergi di banyak jaringan.

Reseptor antigen chimeric * adalah protein fusi rekombinan yang menghubungkan fragmen antibodi yang secara selektif dapat mengikat antigen spesifik dan domain pensinyalan yang mengaktifkan sel T.

Penggunaan reseptor antigenik chimeric yang menargetkan protein CSPG4 juga bisa menjadi metode yang agak efektif untuk memerangi glioblastoma.

Selain itu, analisis MRI menunjukkan pelanggaran penghalang darah-otak di dalam glioblastoma. Oleh karena itu, perawatan yang berhubungan dengan matriks ekstraseluler harus efektif.

Dan di sini imajinasi besar dan kreativitas para ilmuwan memasuki lokasi. Faktanya adalah Anda dapat menggunakan peptida dan antibodi standar sebagai reagen yang ditargetkan ECM, tetapi ini tidak terlalu menyenangkan. Oleh karena itu, para ilmuwan memutuskan untuk menggunakan reseptor limfosit variabel (VLR), yaitu reseptor antigen lampreys.


Kelas lamprey memiliki sekitar 40 spesies, yang sebagian besar adalah parasit yang memakan darah ikan, yang mereka hisap.

VLR adalah protein kaya sabit, kaya leusin yang mengenali target antigenik dengan spesifisitas dan afinitas * yang sebanding dengan antibodi berbasis imunoglobulin.

Afinitas * adalah karakteristik termodinamika kekuatan interaksi zat-zat seperti antigen dan antibodi.

Mengapa tepatnya lamprey dan VLR mereka? Faktanya adalah bahwa antara mamalia dan lamprey ada jurang evolusi 500 juta tahun. Dengan demikian, VLR lamprey lebih mungkin mengenali protein dan glikans yang dikonservasi dalam ECM daripada antibodi mamalia.

Untuk mengidentifikasi VLR yang mengikat ECM otak, para ilmuwan melakukan panning, metode untuk memilih bio-elemen spesifik (protein, petite, dll.) Dari perpustakaan VLR biomolekul. Hasilnya adalah kumpulan klon pengikat ECM * .

Klon * - sekelompok sel identik yang memiliki nenek moyang yang sama (sumber primer), yaitu, berasal dari sel yang sama.

Klon yang dihasilkan menunjukkan akumulasi preferensial baik di daerah hancur penghalang darah-otak pada hewan dengan gangguan osmotik dari BBB atau dengan glioblastoma. Selain itu, klon tersebut juga ditujukan untuk liposom * sarat dengan doxorubicin (antibiotik).

Liposom * - organel intraseluler bola yang digunakan untuk mengantarkan obat ke jaringan tertentu.

Persiapan belajar

Seperti yang telah kita pelajari sebelumnya, VLR yang mengikat ECM diidentifikasi dengan menggeser perpustakaan VLR. Perpustakaan itu sendiri diperoleh dari kumpulan lamprey VLR yang diimunisasi dengan preparasi yang diisolasi secara mekanis dari membran plasma dari mikrovasculature otak tikus, yang berisi ECM otak yang terkait.

Perpustakaan pertama diperkaya dengan pengikat ECM menggunakan dua siklus panning pada * ECM decellularized yang dihasilkan oleh sel endotel tikus yang dikultur (garis sel 3 bEnd).

Dekellularisasi * adalah metode memurnikan allografts dari komponen seluler untuk mendapatkan konstruksi non-imunogenik, efektif dan aman berdasarkan matriks ekstraseluler alami.

Lebih lanjut, perlu untuk mengidentifikasi secara tepat klon pengikat ECM yang dominan membengkokkan pada EC3 ketiga, dan tidak dengan kelompok kontrol ECM fibroblast tikus (garis sel 3T3).

Selanjutnya, masing-masing klon ditempatkan di 96-well plate, setelah itu mereka diperluas dan diinduksi untuk menampilkan VLR. Setelah menghapus klon tambahan (sehingga tidak ada subkloning), para ilmuwan dapat melakukan penilaian komparatif pengikatan VLR ke bEnd.3 dan 3T3 ECM menggunakan skrining ELISA ( 1a ).


Gambar No. 1

Sebanyak 285 klon dianalisis. Akibatnya, dapat dilihat bahwa sinyal komunikasi dengan bEnd.3 ECM kira-kira 5 kali lebih kuat daripada sinyal komunikasi dengan 3T3 ECM ( 1b ).

Selanjutnya, hasil ELISA diperiksa dengan membandingkan gambar mikroskop bidang terang dari klon yang terkait dengan bEnd.3 dan 3T3 ECM ( 1C ).

Seperti dapat dilihat pada gambar 1c , klon P1C10 dan P2C7 mengikat secara eksklusif ke bEnd.3 ECM, dan klon tidak mengikat P1E9 praktis tidak menunjukkan koneksi dengan jenis ECM.

Selanjutnya, para ilmuwan melakukan analisis komparatif dari metode yang lebih praktis - pada bagian otak tikus. Delapan dari 10 klon VLR yang menunjukkan hasil pengikatan terbaik dalam pengamatan sebelumnya juga menunjukkan pengikatan ( 1d ) dalam pengujian ini.

Semua klon yang mengikat menunjukkan skema EMC parenkim difus tanpa pengayaan tambahan (vaskular atau seluler).

Para ilmuwan mengidentifikasi 2 pemimpin menurut hasil semua pengamatan di atas - P1C10 dan P3A8. Klon inilah yang akan dipertimbangkan di masa depan.

Hasil penelitian

P1C10 dan P3A8 difungsikan dengan pewarna fluoresen Cy5. Immunostaining langsung dari jaringan murine menggunakan konjugat VLR-Cy5 menunjukkan bahwa P1C10-Cy5 memiliki selektivitas yang signifikan terhadap ECM otak dibandingkan dengan jaringan ginjal, jantung, dan hati ( 2a ).


Gambar No. 2a

Imunostaining * - suatu proses yang memungkinkan Anda untuk mengidentifikasi dan melokalisasi antigen di area sel, jaringan atau organ tertentu.

Tetapi P3A8-Cy5 berikatan dengan ECM otak dan hati dengan intensitas yang sama, tetapi seperti P1C10-Cy5 tidak menunjukkan minat pada ECM ginjal dan jantung.

Selanjutnya, para ilmuwan menguji reaktivitas silang P1C10 dan ECM otak manusia (cryosections digunakan). Pengikatan P1C10-Cy5 ke ECM otak manusia menyerupai gambar dari proses yang sama, tetapi melibatkan otak tikus ( 2b ). P1C10-Cy5 juga berhasil mengikat ECM dalam cryosections dari sampel glioblastoma manusia ( 2c ).


Gambar No. 2b-e

Dengan pengamatan ini, para ilmuwan mengukur afinitas * P1C10.

Afinitas * - kemampuan sel untuk menangkap dan mengikat bahan kimia tertentu.

Akibatnya, konstanta disosiasi (Kd) untuk mengikat ke bEnd.3 ECM adalah 48,38 ± 6,05 nM ( 2d ).

Setelah ini, para ilmuwan memutuskan untuk memeriksa apakah P1C10 akan menumpuk di tempat-tempat penghancuran BBB di otak tikus.

Dimodifikasi oleh pewarna dekat inframerah IR800 klon P1C10 atau RBC36 diperkenalkan ke tikus laboratorium yang sehat dalam volume 1 mg / kg RBC36 adalah VLR yang mengenali trisaccharide dari antigen H manusia, itulah sebabnya ia digunakan sebagai kontrol isotipe.

Selanjutnya, tikus disuntikkan secara intravena dengan manitol (alkohol heksahidrik) untuk sementara membuka BBB. Setelah itu, gambar otak diambil dari tikus untuk mengidentifikasi sinyal IR800 (gambar di bawah).


Gambar No. 3

Analisis komparatif menunjukkan bahwa akumulasi fluoresensi di otak (konsentrasi zat uji yang ditandai dengan pewarna IR800) saat menggunakan P1C10-IR800 adalah 3,3 kali lebih tinggi dibandingkan dengan RBC36-IR800, dan 7,6 kali lebih tinggi daripada saat menggunakan saline. Akibatnya, P1C10 secara selektif terakumulasi di otak setelah kerusakan sawar darah-otak.

Selanjutnya, para ilmuwan memutuskan untuk memeriksa apakah VLR akan menargetkan matriks ekstraseluler telanjang. Untuk ini, dua model diciptakan menggunakan murine GL261 dan sel glioblastoma U87 manusia, yang dimasukkan ke dalam otak tikus percobaan. Akibatnya, tumor dibentuk dengan pembuluh darah yang kacau dan gangguan titik penghalang darah-otak.

P1C10 atau RBC36 dalam volume 1 mg / kg diberikan secara intravena untuk tikus dengan glioblastoma GB261 tertanam. Setelah 30 menit, sampel otak diambil untuk menganalisis dan memvisualisasikan sinyal IR800 (pewarna untuk P1C10 atau RBC36).


Gambar No. 4

Intensitas fluoresensi rata-rata di daerah tumor GL261 pada tikus yang disuntikkan dengan P1C10-IR800 adalah 112 kali lebih tinggi daripada di daerah kontralateral (berlawanan) dari otak ( 4a ). Tetapi ketika menggunakan RBC36-IR800, intensitas fluoresensi wilayah tumor hanya 9 kali lebih tinggi dari intensitas di wilayah yang berlawanan.

Selain itu, ditemukan bahwa akumulasi P1C10-IR800 dalam tumor itu sendiri adalah 13 kali lebih tinggi daripada akumulasi RBC36-IR800.

Pengamatan ini mengkonfirmasi kemampuan P1C10 untuk secara selektif menargetkan ECM pada tumor tikus. Sekarang perlu untuk menguji bakat ini pada tumor otak manusia.

VLR diberikan pada tikus dengan U87 (tumor otak manusia). Para ilmuwan menguji tidak hanya P1C10, tetapi juga 192, yang menunjukkan pengikatan selektif pada sisi basolateral pembuluh darah otak di samping pembuluh ginjal dan hati, serta ECM.

P1C10, 192 atau RBC36 dalam volume 3 mg / kg diberikan secara intravena dan dibiarkan beredar bebas selama 30 menit. Setelah itu, sampel organ yang menarik diambil untuk memvisualisasikan hasilnya.

Kedua klon VLR (P1C10 dan 192) menunjukkan akumulasi pada batas tumor, dengan P1C10 didistribusikan ke seluruh ECM tumor ( 4b ). Tetapi sebagian besar terkonsentrasi di luar pembuluh tumor besar.

Tak satu pun dari klon VLR yang terakumulasi di belahan kontralateral yang sehat dari otak tikus. Dan RBC36 sama sekali tidak ada baik di bagian otak yang sehat maupun di tumor.

Analisis kuantitatif menunjukkan bahwa P1C10 terakumulasi dalam tumor U87 21,2 kali lebih banyak daripada di daerah kontralateral otak, 21,2 kali ginjal, 15,9 kali hati, dan 29,6 kali jantung.

Akumulasi P1C10 dan 192 di daerah tumor adalah 25,4 dan 11,9 kali lebih besar dari akumulasi RBC36. Pada saat yang sama, kedua klon VLR terutama terakumulasi di daerah-daerah cacat pembuluh darah tumor.

Pengamatan ini mengkonfirmasi efektivitas P1C10 dan fokus selektif pada ECM otak. Masih harus dilihat apakah P1C10 dapat secara efisien mengirimkan obat ke tempat yang mereka butuhkan.

Para ilmuwan telah menggunakan VLR dalam kombinasi dengan liposom yang mengandung doxorubicin, yang sangat divisualisasikan karena fluoresensi mereka sendiri, yang sangat menyederhanakan proses menganalisis efektivitas aplikasi VLR. Liposom diperoleh dengan diameter rata-rata 94,2 nm dan kandungan doxorubicin 1 sampai 2 mg / ml. Selanjutnya, klon VLR dilekatkan pada liposom, yang mempertahankan aktivitas pengikatannya setelah digabungkan (gambar No. 5).


Gambar No. 5

Untuk menunjukkan kelayakan pengobatan dengan liposom yang mengandung doxorubicin yang menargetkan VLR, sel tumor U87 (dikultur pada tanggal 3 ECM) diinkubasi dengan liposom yang mengandung doxorubicin yang menargetkan P1C10 atau RBC36.

Pengamatan menunjukkan pertumbuhan yang signifikan dalam sel-sel yang dihancurkan oleh liposom yang menargetkan P1C10. Konsentrasi efektif setengah maksimum adalah 199.0 ± 1.7 nM untuk P1C10 dan 3312.0 ± - 2.6 untuk RBC36.


Gambar No. 6

Dan akhirnya, para ilmuwan menguji utilitas terapi potensial dengan menargetkan matriks ekstraseluler otak yang rusak secara patologis. Untuk ini, liposom yang mengandung doxorubicin dalam kombinasi dengan P1C10, 192 atau RBC36 digunakan pada tikus percobaan dengan sel kanker U87.

Seperti dapat dilihat pada gambar 6a dan 6b , sinyal dari doxorubicin jauh lebih kuat ketika menggunakan P1C10. Dapat dilihat bahwa sinyal ini cukup terlokalisasi di dalam tumor dan tidak memengaruhi wilayah kontralateral (sehat) otak.

Gambar 6c dan 6d menunjukkan bahwa akumulasi P1C10 di wilayah tumor adalah 7,6 kali lebih tinggi daripada di wilayah sehat. Jika kita membandingkan tingkat akumulasi P1C10 dengan RBC36, maka perbedaannya adalah 7,9 kali mendukung P1C10.

Selama 4 minggu (pada hari ke 7, 14, 21, dan 28), 12 mg / kg doxorubicin diberikan pada tikus percobaan dengan U87 menggunakan P1C10, 192, atau RBC36.

Setelah pengenalan tumor, kelangsungan hidup rata-rata adalah: 43 hari untuk P1C10, 30 hari untuk 192, dan 28 hari untuk RBC36.

Sekelompok subjek dengan P1C10 menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam kelangsungan hidup dibandingkan dengan dua kelompok lainnya. Pada saat yang sama, indikator 192 dan RBC36 tidak berbeda secara signifikan dari indikator kelompok kontrol yang tidak menerima perawatan sama sekali.

Untuk seorang kenalan yang lebih mendetail dengan nuansa penelitian, saya sarankan Anda membaca laporan para ilmuwan .

Epilog

Tidak akan ada kebahagiaan, tetapi kemalangan membantu. Dengan frasa ini Anda dapat dengan tepat menggambarkan penelitian ini. Para ilmuwan menggunakan gangguan patologis penghalang darah-otak sebagai alat untuk mengirimkan obat ke daerah-daerah tertentu dari otak yang terkena tumor, sambil menghindari daerah yang sehat. Dan para ilmuwan menerima bantuan dalam upaya yang rumit dan mulia ini, seperti yang mereka katakan, dari tempat mereka tidak menunggu. Lampyca variabel reseptor limfosit (VLR) menjadi dasar dari penelitian ini. Sekarang aman untuk mengatakan bahwa bahkan parasit dapat bermanfaat.

Perawatan tumor otak penuh dengan daftar besar kesulitan, dan keberhasilan proses ini tidak sebesar yang kita inginkan. Penciptaan metode dan sarana baru untuk memerangi penyakit serius semacam itu adalah tujuan ilmu pengetahuan. Mengetahui dunia di sekitar dan di dalam diri kita, kita tidak melawan kehendak alam, kita hanya mulai memahaminya dengan lebih baik, menemukan pengetahuan baru dan menerapkannya untuk kebaikan.


Terima kasih telah tinggal bersama kami. Apakah Anda suka artikel kami? Ingin melihat materi yang lebih menarik? Dukung kami dengan melakukan pemesanan atau merekomendasikannya kepada teman-teman Anda, diskon 30% untuk pengguna Habr pada analog unik dari server entry-level yang kami temukan untuk Anda: Seluruh kebenaran tentang VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps dari $ 20 atau bagaimana membagi server? (opsi tersedia dengan RAID1 dan RAID10, hingga 24 core dan hingga 40GB DDR4).

VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps hingga musim panas gratis ketika membayar untuk jangka waktu enam bulan, Anda dapat memesan di sini .

Dell R730xd 2 kali lebih murah? Hanya kami yang memiliki 2 x Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 TV dari $ 199 di Belanda! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - mulai dari $ 99! Baca tentang Cara Membangun Infrastruktur Bldg. kelas menggunakan server Dell R730xd E5-2650 v4 seharga 9.000 euro untuk satu sen?