Sebelum membaca pemutakhiran ini, disarankan untuk membiasakan diri dengan kode sumber yang diterbitkan sebelumnya .Minion sequencer pori nanion pertama dan paling populer (set minimum di Inggris adalah $ 1000, di Rusia - 150 ribu rubel), yang dikembangkan oleh Oxford Nanopore Technologies (ONT), beroperasi pada sel sekali pakai, yang masing-masing harganya $ 900 (dalam Rusia - 135 ribu rubel). Sel semacam itu memungkinkan Anda untuk mendigitalkan DNA 10 ... 20 Gb dalam 2 ... 3 hari. Ini terlalu sedikit untuk mengurutkan genom manusia (Anda membutuhkan> 100 Gb), tetapi terlalu banyak untuk semua tujuan diagnostik klinis lainnya (<1 Gb sudah cukup).
Baru-baru ini mulai menjual model yang lebih produktif (dan lebih mahal) - PromethION 24/48 ($ 165.000 / $ 285.000), yang ditujukan terutama untuk sekuensing in-line genom lengkap. Lebih mahal adalah bahan habis pakai yang lebih efisien ($ 2.000 / unit,> 100 Gb). Benar, mereka bisa lebih murah dalam jumlah besar ($ 1.800.000 untuk 2.880 pcs., $ 625 / pcs.), Tetapi akuisisi tersebut (200 ... 250 juta rubel per batch) tidak diizinkan untuk anggaran Rusia.
Dan tidak hanya untuk orang Rusia. Oleh karena itu, perhatian pengunjung pada konferensi ONT baru-baru ini (22-24 Mei) tertarik dengan pengumuman awal penjualan Flongle, sebuah insert adapter untuk sequencer MinION, yang memungkinkan bekerja dengan sel-sel disposable Minion yang kurang efisien (~ 1 Gb), tetapi relatif murah ($ 90).
https://nanoporetech.com/productsMunculnya Flongle dapat menyebabkan pertumbuhan eksplosif dalam penggunaan NGS (sequencing generasi berikutnya) dalam praktik klinis dan menggantikan diagnostik PCR konvensional, yang ukuran pasarnya di Rusia melebihi satu miliar rubel, dan di dunia diukur dalam miliaran dolar. Tetapi untuk sebagian besar pasien Rusia, diagnostik NGS masih akan tetap menjadi kemewahan yang tidak dapat diterima, karena biaya sel untuk Flongle di pasar domestik akan lebih dari 10 ribu rubel. Dan jika kita menambahkannya biaya reagen yang dapat dihabiskan, biaya transportasi dan overhead, maka perkiraan biaya sekuensing satu sampel DNA / RNA tidak akan jatuh di bawah 20 ribu rubel.
Ini menyiratkan kebutuhan untuk mengembangkan sequencer nanopore domestik dan menyediakan bahan habis pakai dan reagen yang murah.
Nanorider
Secara signifikan mengurangi biaya sekuensing nanopore dimungkinkan dengan menggunakan kembali sel untuk Flongle dan mengimpor substitusi reagen yang diperlukan untuk bekerja dengannya. Tetapi pertama-tama Anda perlu mendapatkan perangkat uji yang memungkinkan Anda untuk memantau pembentukan membran lipid bilayer (BLM) di 126 sumur sel yang bekerja, dan mengevaluasi kuantitas dan kualitas nanopori yang tertanam dalam membran ini. Perangkat semacam itu ("Nanorider"?) Harus melacak perubahan konduktivitas listrik (dan / atau impedansi) lubang individu selama pembentukan BLM pada mereka, dan mendaftarkan arus picoamper yang mengalir melalui saluran ion tunggal.
Dimungkinkan untuk menyusun pembaca yang terhubung ke komputer melalui USB 2.0 dari elemen standar: FPGA (100 ... $ 200), amplifier saat ini (MAX9923FEUB - 200 ... 300 rubel), ADC (1 ... 2 ribu rubel), dll ... hanya papan dengan pad kontak non-standar (10x13) jenis LGA (Land Grid Array) untuk docking dengan sel dari Flongle. Atau dengan mitra domestiknya yang disederhanakan berisi sejumlah kecil (16 ... 32) sumur sensor.
Sentuh Pad Sel FlongleMengurangi produktivitas sel yang dihitung dengan 4 ... 8 kali (hingga 10 ... 20 Mb) tidak penting untuk menyelesaikan banyak masalah (menentukan patogen, pengetikan HLA, menetapkan ayah, mengidentifikasi seseorang, dll.), Tetapi memungkinkan Anda untuk merakit sequencer nanopore menggunakan penguat konvensional. arus picoampere. Dan lakukan tanpa menggunakan chip 512-channel khusus, pengembangan yang telah diinvestasikan Oxfordians puluhan juta dolar. Benar, setiap nanoreader multichannel harus mengandung lebih dari selusin amplifier + ADC saat ini, tetapi masih bisa berharga beberapa kali lebih sedikit daripada kombinasi Minion + Flongle yang dipatenkan (> 200 ribu rubel). Adapun kinerja rendah dari nanoreader, untuk pengguna Rusia yang tidak memiliki komputer yang layak (dokter, ahli biologi, biohackers, dll.), Bahkan dapat bermanfaat.
Kilorider
Amplifier picoampere 512-channel yang dikembangkan oleh Oxfordian terkandung dalam setiap sel sekali pakai untuk MinION. Sel-sel limbah dapat dibuang, tetapi lebih baik menggunakan chip yang terkandung di dalamnya untuk menghasilkan analog Flongle yang ditandai dengan peningkatan produktivitas. Jika chip ini dilengkapi dengan kontak permukaan, mereka akan dapat bekerja dengan sel kontak yang berisi 2048 (512x4) sumur sensor.
Mendesain sel dengan LGA semacam itu tidak akan mudah, tetapi Anda perlu mempertimbangkan bahwa persyaratan kontak di sini kurang ketat dibandingkan prosesor dan motherboard, di mana satu kontak yang buruk dapat menonaktifkan seluruh sistem. Untuk sequencer, bahkan setengah dari kontak sel yang tidak dapat dioperasikan dapat dianggap dapat diterima. Setengah sisanya cukup untuk memastikan kinerja di level 5 ... 10 Gb.
Pengembangan logis dari ide ini akan menjadi kombinasi dari beberapa pembaca serupa dalam satu perangkat. Ini akan memungkinkan Anda untuk mendapatkan sequencer analog GridION X5, yang dirancang untuk bekerja secara simultan dengan lima (atau lebih) sel produksi dalam negeri yang dapat digunakan kembali. Sequencer semacam itu mungkin dibutuhkan di banyak laboratorium diagnostik klinis.
https://store.nanoporetech.com/devicesSel sequencer PromethION sekali pakai mengandung 9.000 sumur sensor pada chip. Dan chip itu sendiri adalah amplifier 3000-channel dari arus picoampere. Aliran informasi yang mereka berikan dengan 24 (PromethION 24) atau 48 (PromethION 48) sel informasi sangat besar sehingga dalam bentuk mentah tidak dapat ditransfer ke komputer eksternal biasa. Oleh karena itu, sequencer tipe ini harus dilengkapi dengan superkomputer mereka sendiri. Tetapi jika sequencer hanya akan bekerja dengan satu sel, maka ia dapat dihubungkan ke laptop gaming biasa dengan port Thunderbolt 3.0.
Perubahan chip (ejected) gratis dari ONT agar bekerja dengan sel kontak bukanlah masalah yang tidak terpecahkan. Tetapi sequencer yang dibangun berdasarkan penggunaan chip semacam itu hanya dapat bekerja dengan perangkat lunak ONT. Dan upaya yang harus dikeluarkan untuk membuat kembali program-program ini dapat meniadakan manfaat menggunakan chip yang tidak tersedia. Dan mengembangkan chip seperti itu dari awal terlalu mahal.
Mega Rider
Tahun ini, pengujian beta dari sequencer nanopore dari AXBIO (AS) akan dimulai. Ia menggunakan chip dengan satu juta saluran amplifikasi saat ini yang diproduksi di Jepang oleh perusahaan Israel Tower Semiconductor Ltd ... Bahan habis pakai dan penjualan sequencer ini akan ditangani oleh AXBIO cabang Cina.
Di Amerika Serikat dan Uni Eropa, lebih dari 7.000 paten dikhususkan untuk sekuensing nanopore, yang menciptakan risiko keuangan yang tidak dapat diprediksi bagi perusahaan lokal yang mencoba menangani teknologi tersebut. Rupanya, inilah alasan utama tingginya internasionalisasi perkembangan ini. Dan itu memungkinkan perusahaan dan laboratorium Rusia untuk berpartisipasi tanpa batasan dalam menguji dan meningkatkan teknologi AXBIO, serta memproduksi (atau mengumpulkan) sequencer seperti itu di wilayah mereka.
Terabyte data mentah diperoleh oleh sequencer nanopore dengan chip megapiksel (mega reader), diinginkan untuk disaring. Dan transfer ke komputer hanya membaca terlama dan berkualitas tinggi. Ini tidak hanya akan meningkatkan kualitas sequencing, tetapi juga mengurangi persyaratan untuk komputer, yang juga penting untuk produksi massal dan meluasnya penggunaan sequencer genom. Selain itu, produktivitas berlebihan pembaca mega dapat mengurangi durasi pengurutan genom manusia dari 2 ... 3 hari (untuk ONT) menjadi beberapa jam.
Jumlah Teknologi
Keberhasilan ONT difasilitasi oleh organisasi optimasi pipa paralel dari lima elemen utama teknologi sekuensing nanopore - membran, nanopori, "motor" (helikopter), kondisi sekuensing, dan penguraian algoritma untuk sinyal yang dibaca.
https://nanoporetech.com/resource-centre/videos/sub1000Umur simpan sel yang dijamin untuk sekuensing nanopore tergantung terutama pada stabilitas membran lipid bilayer. Sekarang sudah 6 minggu, meskipun biasanya selaput tersebut hancur dalam beberapa hari. Untuk meningkatkan umur simpan, aditif polimer hidrofobik, kopolimer blok aktif-permukaan, kolesterol, antioksidan, ikatan silang asam lemak, dll digunakan, dan modifikasi semacam itu dapat mengganggu pembentukan saluran ion. Karena itu, sangat sulit untuk mencapai stabilitas BLM.
Memecahkan masalah ini secara radikal memungkinkan pembentukan membran dalam sel-sel kerja sequencer dan pengenalan nanopori ke dalamnya segera sebelum digunakan. Persiapan sel sendiri untuk bekerja akan memberikan kesempatan untuk regenerasi dan penggunaan kembali. Adapun umur simpan, untuk sel-sel kering hampir tak terbatas, dan reagen yang diperlukan untuk aktivasi dan regenerasi dapat disimpan selama berbulan-bulan.
Kemacetan dalam teknologi sekuensing nanowire pada saat yang sama adalah kemacetan nanopore, di mana kualitas informasi yang dibaca tergantung. Oleh karena itu, salah satu tugas utama ONT adalah mencari protein membran, yang memungkinkan memperoleh hasil dengan kualitas yang dapat diterima.
Protein seperti pertama adalah CsgG, protein membran luar yang ditemukan di banyak bakteri gram negatif. Sembilan subunitnya membentuk saluran ion di membran dengan pintu masuk dan keluar lebar, dan satu hambatan. Tapi itu mungkin untuk mendapatkan nanopores berkualitas tinggi yang cukup (R9, R9.4.1, R9.5.1) hanya setelah menghitung dan menganalisis ratusan varian CsgG yang dimodifikasi. Musim panas ini, sel-sel dengan pori-pori generasi berikutnya (R10 atau R10b) akan muncul di pasaran, menampilkan peningkatan akurasi dalam membaca pengulangan homopolimer.
https://nanoporetech.com/about-us/news/london-calling-clive-brown-and-team-plenaryONT adalah komponen wajib dari teknologi sekuensing nanopore ONT, sebuah helicase, motor molekuler yang melepaskan DNA beruntai ganda dan menghambat kemajuan DNA beruntai tunggal melalui nanopore. Kecepatan maksimum DNA yang dililitkan oleh motor seperti itu sekarang mencapai 450 pasangan nukleotida per detik, meskipun kecepatan komponen elektronik MinION memungkinkannya ditingkatkan menjadi 1000 nukleotida per detik. Secara teoritis, mempercepat pekerjaan helicase dapat melipatgandakan kinerja MinION, tetapi dalam praktiknya hal ini dapat menyebabkan urutan yang buruk. Oleh karena itu, helikase yang lebih cepat dan lebih efisien tidak mungkin meningkatkan kinerja sequencer nanopore seperti MinION dan PromethION.
Kualitas urutan tergantung pada banyak kondisi - besarnya tegangan yang diterapkan pada membran, konduktivitas listrik dan komposisi ion dari campuran reaksi, jumlah dan sifat pengotor yang menyumbat pori-pori, kemampuan untuk membersihkan pori-pori yang tersumbat dengan mengubah polaritas potensi, struktur adaptor yang digunakan, dll., Dll. ... Oleh karena itu, nanopore pengurutan membutuhkan pengoptimalan yang hati-hati dari semua parameter dan komposisi solusi kerja (Kondisi Kondisi), yang dapat mempengaruhi kualitas digitalisasi urutan nukleotida awns. Sebagai contoh, baru-baru ini diperlihatkan bahwa penurunan konsentrasi ATP yang dibelah oleh helicase secara bertahap menurunkan akurasi hasil sekuensing, dan sekarang orang Oxford berusaha menghilangkan masalah ini dengan memasukkan sistem regenerasi ATP ke dalam campuran reaksi.
Elemen kelima dari teknologi sekuensing nanopore adalah kecerdasan buatan yang dibangun di atas jaringan saraf berulang (RNN) dan pada penggunaan beberapa algoritma dan program khusus yang meningkatkan pengenalan pengulangan homogen (Flip-flop, Medaka). Pada bulan Juli, rilis berikutnya dari program Guppi dan MinKNOW akan muncul, di mana Oxfordians berjanji untuk menambah kemampuan untuk menentukan basis teralkilasi (5mC dan 6mA). Ini penting tidak hanya untuk studi epigenomik, tetapi juga untuk meningkatkan pengenalan basa konvensional.
Volume besar informasi yang dibaca oleh sequencer nanopore dan kompleksitas pemrosesan memaksakan peningkatan persyaratan pada perangkat keras dari perangkat lunak dan sistem perangkat keras tersebut. Oleh karena itu, tidak setiap komputer cocok untuk menghubungkan MinION, akselerator grafis generasi terbaru dipasang di GridION dan PromethION, dan Oxford Nanopore Technologies menjadi salah satu pembeli pertama dari sejumlah besar modul Jetson AGX Xavier (NVIDIA) yang ditujukan untuk perangkat dengan kecerdasan buatan.
Baru-baru ini, teknologi nanopore dianggap tidak lebih dari pelengkap yang berguna untuk teknologi fluoresensi dan semikonduktor yang lebih akurat. Tetapi peningkatan bertahap dalam akurasi membaca DNA, dikombinasikan dengan sekuens panjang yang dapat dibaca, memungkinkannya, jika tidak untuk maju dari semua pesaing, maka setidaknya menentukan vektor utama pengembangan teknologi sekuensing genom.
Mungkin butuh waktu cukup lama untuk menguasai semua elemen teknologi sekuensing nanopore, tetapi ini bukan masalah terbesar. Masalah utama adalah kurangnya dana yang ditargetkan untuk pengembangan terintegrasi di Rusia. Benar, Program Ilmiah dan Teknis Federal yang baru-baru ini disetujui untuk Pengembangan Teknologi Genetik untuk 2019-2027 (bagian "Arah Implementasi Program") mengatakan bahwa dalam jangka pendek (3 ... 6 tahun) perangkat prototipe untuk sekuensing genomik berkinerja tinggi akan dikembangkan. Tetapi menemukan satu baris ini pada 30 halaman teks tidaklah mudah. Lebih mudah untuk bernegosiasi dengan Cina mengenai pembelian sequencer AXBIO.
Yang lebih sederhana adalah menemukan pengrajin yang dapat merakit nanorider paling sederhana "di lutut". Dan kemudian berjalan dengan tangan terulur untuk mencari investor yang setuju untuk membiayai pengembangan teknologi dalam negeri sequencing nanopore.