🏦 ⛹🏽 🏼 Mikrobiota. Sejarah studi dan metode penelitian 🔌 👨🏾 🈷️

Kami menerima banyak komentar pada artikel terakhir dan memutuskan dengan Atlas untuk melengkapi seri ini dengan materi tentang apa metode lain mempelajari mikrobiota. Di akhir artikel, mereka menambahkan bahwa Anda perlu mengingat tentang penelitian bakteri usus hari ini agar tidak membahayakan kesehatan Anda.

Ilustrasi oleh Rentonorama

Bagaimana studi tentang mikrobiota dimulai?

Mikrobiota usus disebut organ baru dalam tubuh manusia. Kita telah sedikit banyak mengetahui tentang organ-organ lain untuk waktu yang lama, tetapi baru diketahui pada akhir abad ke-20 bahwa bakteri melakukan fungsi-fungsi penting bagi manusia. Studi tentang mikrobiota dimulai pada abad XVII. Pencipta mikroskop dan "bapak mikrobiologi," Anthony Van Levenguk, pertama kali memeriksa dan menggambarkan bakteri di rongga mulut dan feses.

Pada tahun 1828, Christian Ehrenberg memperkenalkan istilah baru Bacterium. Pada saat itu, ia sedang mempelajari Escherichia coli (Escherichia coli), spesies bakteri tanpa spora. Untuk bakteri pembentuk spora, Christian menciptakan istilah Bacillus. Jenis bakteri ini secara aktif dipelajari oleh Robert Koch. Dia juga mengungkapkan hubungan antara perwakilan patogen dari genus ini dan penyakit seperti antraks dan TBC.

Sudah di abad ke-19, para peneliti memahami bahwa kesehatan manusia terkait erat dengan bakteri. Namun, studi lengkap tentang mikrobiota menjadi mungkin setelah penemuan teknologi sekuensing gen oleh Frederick Senger. Tidak semua spesies dapat hidup dan tumbuh di cawan Petri, sehingga sulit untuk mengklasifikasikan dan menentukan fungsi bakteri secara detail.

Seiring dengan perkembangan teknologi di tahun 70-an, ahli mikrobiologi Karl Vöze mengusulkan klasifikasi mikroorganisme berdasarkan urutan molekul rRNA 16-an, yang memudahkan untuk membandingkan urutan nukleotida dan menentukan tingkat afinitas. Menurut analisis, Karl membagi semua mikroorganisme menjadi archaea, bakteri dan eukariota. Klasifikasi ini digunakan sekarang.

Eukariota dibedakan dengan adanya nukleus, tetapi bakteri dan archaea tidak. Archaea adalah mikroorganisme bersel tunggal sederhana yang hidup dalam kondisi ekstrem (di geyser, di dasar laut dan samudera). Dan mereka adalah yang paling kuno: archaea ada di Bumi selama sekitar 4 miliar tahun. Juga, di antara mereka tidak ada mikroorganisme parasit dan patogen, dan di antara bakteri ada, meskipun tidak sebanyak yang kita pikirkan - sekitar 1%.

Di usus manusia, archaea menghasilkan metana. Juga, semakin banyak, semakin rendah risiko obesitas, tetapi hubungan kausal tetap tidak jelas. Tidak semua memiliki archaea dan jarang melampaui 1-2%.

Bakteri hidup di berbagai lingkungan dan kami lebih banyak berhubungan dengan mereka daripada dengan archaea. Mereka berbeda dalam sejumlah fungsi. Sebagai contoh, bakteri dapat memecah molekul karbohidrat dan menghasilkan asam lemak, sedangkan archaea tidak bisa.

Cara belajar mikrobiota

Sebelum terjun ke penelitian, mari kita menyegarkan kembali pengetahuan kita tentang DNA, RNA, dan sintesis protein.

Tubuh membutuhkan protein agar berfungsi dengan baik. Jaringan kulit, untuk mempertahankan fungsi pelindung, memerlukan satu; sel-sel mata, sehingga organ bekerja dengan benar, berbeda. Terkadang sel dan jaringan yang berbeda membutuhkan protein yang sama. Untuk membuat protein, sel menggunakan DNA sebagai instruksi.

Pertama, area di mana informasi yang diperlukan terkandung ditentukan. DNA beruntai ganda tidak dilepas dan hanya satu sisi yang disalin. Kemudian DNA tersebut dililit kembali, dan salinan salah satu sisinya (RNA) mengambil ribosom. Dia membaca urutan dan membangun di atasnya rantai asam amino, yang kemudian terbentuk dan menjadi protein.

Ini bisa dibandingkan dengan memasak menurut buku resep lama. Pertama, kami menulis resep agar tidak menggunakan buku rapuh, tetapi berharga sekali lagi. Selanjutnya pada resep, kami menggabungkan produk yang berbeda, seperti ribosom asam amino, untuk mendapatkan hidangan jadi. Untuk sel, hidangan adalah protein yang digunakan lebih lanjut untuk kebutuhannya. Selain protein, mikroorganisme menghasilkan senyawa lain, seperti asam lemak, yang dianggap metabolit.

Untuk mempelajari mikroorganisme, empat pendekatan terutama digunakan: penelitian metagenomik - DNA, penelitian metatranscriptomik - RNA, metaproteomik - penelitian protein, metabolisme - penelitian metabolit.

Sequencing Metagenomic

Metagenome - satu set gen dari semua organisme di lingkungan yang diteliti. Inti dari analisis ini adalah pengurutan gen rRNA 16-an, yang bertanggung jawab untuk operasi RNA ribosom, atau pengurutan semua DNA. Studi semacam itu menjawab pertanyaan "organisme apa yang ada dalam sampel dan fungsi apa yang berpotensi mereka lakukan?" Kami berbicara tentang teknologi ini secara rinci dalam artikel sebelumnya, karena tes "Microbiota Genetics" dibangun di atasnya.

Biasanya, penelitian mikrobiota mengacu pada jenis analisis khusus ini, karena ini adalah yang pertama digunakan dalam skala besar untuk mempelajari bakteri. Setelah munculnya teknologi pengurutan DNA, para ilmuwan meluncurkan proyek global untuk mempelajari tanah, laut, sumber air panas. Berkat analisis metagenomik, database mikroorganisme telah tumbuh secara eksponensial. Sequencing memungkinkan Anda untuk mempelajari bakteri di lingkungan alami, sementara dalam kondisi laboratorium, banyak dari mereka mati.

Pada tahun 2007, para peneliti AS memulai sebuah proyek untuk mempelajari mikrobioma tubuh manusia . Itu menjadi dorongan untuk studi skala besar tentang komposisi bakteri usus berdasarkan data metagenomik. Mengikuti HMP di Eropa pada 2008 meluncurkan proyek serupa untuk mempelajari mikrobiota manusia - MetaHit .

Inti dari studi metagenomik adalah untuk memahami mikroorganisme mana yang hidup dalam sampel, berapa banyak yang ada dan fungsi apa yang mereka lakukan. Analisis tidak secara langsung mengevaluasi senyawa mana yang diproduksi komunitas bakteri. Namun, berkat banyak studi metagenomik, kami dapat memprediksi ini secara tidak langsung. Misalnya, jika seseorang memiliki lebih banyak bakteri-penghasil asam butirat - mikrobiota-nya mungkin memproduksinya dengan baik.

Studi metagenomik tersebar luas karena lebih mudah dilakukan dibandingkan dengan metode lain. Mempelajari RNA, protein, dan metabolit membutuhkan pemurnian sampel yang canggih dan analisis yang lebih memakan waktu.

Menurut data metagenomik, kami memiliki hasil terbanyak. Ini jelas terlihat atas dasar semua artikel ilmiah dan penelitian klinis PubMed. Pencarian untuk mikrobioma metagenomik menghasilkan sekitar 4.500 artikel yang berbeda, total mikrobioma permintaan metatranscriptomik 225, mikrobioma metaproteomik 100, mikroba metabomik 1.600.

Urutan metatranskriptome

Transkrip adalah totalitas semua molekul messenger RNA (mRNA) yang disintesis oleh satu sel atau kelompok mikroorganisme. Dalam analisis metatranskriptome, RNA dipelajari secara langsung, dan bukan gen yang mengkodekannya.

Kebetulan ada bakteri, tetapi tidak berpartisipasi dalam kehidupan komunitas mikroba: ia memiliki gen tidak aktif yang tidak disalin oleh molekul RNA. Studi metatranskriptome memungkinkan kita untuk mengevaluasi secara tepat bagian aktif dari mikrobiota. Namun, molekul RNA tidak stabil seperti DNA, dan meluruh dengan cepat. Oleh karena itu, lebih sulit dan lebih mahal untuk mengisolasi dan menyimpannya untuk analisis.

Seringkali studi transkriptom digunakan untuk mempelajari fungsi gen tertentu. Dalam hal ini, hasil uji RNA diverifikasi terhadap data metagenomik. Jadi para ilmuwan mendapatkan informasi yang lebih lengkap tentang kerja mikroorganisme. Studi metatranskriptome microbiome mungkin berguna untuk lebih akurat menentukan potensi sintesis berbagai metabolit.

Metaproteomik

Dengan pendekatan ini, semua protein yang ada dalam sampel dipelajari. Metaproteomik memberikan informasi tentang struktur, fungsi, dan dinamika komunitas mikroba. Para ilmuwan akan belajar lebih banyak tentang bagaimana organisme berinteraksi satu sama lain, bersaing untuk mendapatkan nutrisi, dan menghasilkan metabolit.

Pertama, protein diisolasi dari sampel. Seringkali, kromatografi cair digunakan untuk ini. Kemudian analisis tambahan dilakukan untuk menentukan berat molekul - spektrometri massa. Jadi kami mendapatkan informasi tentang fragmen protein (peptida), tetapi tidak tentang keseluruhan protein. Untuk mengumpulkan fragmen menjadi satu kesatuan tunggal, program khusus digunakan, dan para ilmuwan menerima data yang sudah jadi.

Metoproteomik saat ini kurang populer daripada studi DNA dan RNA. Ini karena kompleksitas penelitian dan probabilitas kesalahan yang tinggi. Sampel dapat mengandung banyak protein manusia atau makanan. Namun, metaproteomik dapat membantu para ilmuwan menjelaskan interaksi antara bakteri dan gangguan mikrobiota pada orang dengan penyakit.

Metabolomik

Dengan jenis analisis ini, metabolit dipelajari - zat yang diproduksi bakteri. Ini bisa berupa asam amino, lipid, gula, asam lemak (termasuk asam butirat) dan senyawa lainnya. Sekarang sekitar 40.000 metabolit tubuh manusia dijelaskan, dan semuanya dicatat dalam basis data yang besar.

Sebagai sampel untuk studi metabolit, Anda dapat menggunakan cairan apa pun dari tubuh manusia: darah, air liur, urin, lavage usus (pembilasan) dan bahkan cairan serebrospinal. Rata-rata, sekitar 4200 metabolit terkandung dalam plasma darah, 3000 dalam urin, 500 cairan serebrospinal, dan 400 dalam air liur.Namun, lavage digunakan sebagai bahan biomaterial untuk studi mikrobiota.

Prosedur studi metabolit mirip dengan analisis protein. Dengan menggunakan kromatografi cair atau gas yang sama, metabolit pertama kali diisolasi dan kemudian berat molekulnya diukur menggunakan spektrometer massa.

Studi tentang metabolit memiliki keterbatasan. Misalnya, berdasarkan penelitian ini, kami tidak bisa mengetahui dengan pasti metabolit mana yang diekskresikan oleh mikrobiota usus, dan yang kami terima dengan makanan.

Juga, tidak mungkin untuk menghitung berapa banyak bakteri yang terkandung dalam mikrobiota. Oleh karena itu, untuk gambaran yang lebih lengkap, data tentang metabolit disertai dengan hasil analisis metagenomik. Pendekatan ini kadang-kadang digunakan untuk mempelajari bagaimana mikrobiota dan metabolitnya terlibat dalam perkembangan penyakit.

Apa yang harus diingat?

Sejauh ini, tidak ada metode penelitian mikrobiota telah digunakan dalam praktik klinis reguler. Kadang-kadang, untuk gambaran lengkap, dokter dapat merekomendasikan melakukan studi metagenomik mikrobiota untuk mengevaluasi komposisi bakteri usus.

Kami memperingatkan pengguna bahwa tes Microbiota Genetics hanya untuk tujuan pendidikan dan dirancang untuk orang sehat yang tertarik untuk mengenal bakteri mereka. Jika seseorang sakit, maka ia akan dapat mengetahui komposisi bakteri, tetapi rekomendasi dalam kasus ini tidak akan relevan. Mikrobiota orang dengan penyakit sangat berbeda, dan bagi mereka profil "normal" akan berbeda.

Kami tidak menyarankan anak-anak untuk melakukan penelitian, karena data mikrobiota mereka jauh lebih sedikit. Dan intervensi yang tidak perlu dan membatasi diet anak-anak sesuai dengan hasil penelitian berpotensi berbahaya, karena anak mungkin tidak menerima nutrisi yang diperlukan atau mungkin menderita overdiagnosis.

Saat ini, penduduk Rusia dan negara-negara CIS ditawari sebuah studi tentang metabolit mikrobiota untuk anak-anak dan orang dewasa menggunakan sampel darah atau air liur dengan kromatografi gas dan spektrometri massa. Menurut hasilnya, menurut pengembang metode ini, adalah mungkin untuk menilai ada tidaknya peradangan di dalam tubuh.

Namun, tidak ada rekomendasi seperti itu dalam pedoman klinis internasional. Diagnosis peradangan dan penyakit harus dilakukan dengan metode yang memiliki bukti tingkat tinggi, tingkat sensitivitas tertentu, probabilitas rendah hasil positif palsu dan komplikasi overdiagnosis.

Artikel lain tentang mikrobiota usus:

Mikrobiota. Sejarah studi dan metode penelitian