Di California, pada usia 74, Peraih Nobel Amerika di bidang Kimia Carey Mullis meninggal. Menurut istrinya, kematian terjadi pada 7 Agustus. Alasannya adalah gagal jantung dan pernapasan akibat pneumonia.
James Watson, penemu molekul DNA, akan memberi tahu kami tentang kontribusinya pada biokimia dan untuk apa ia menerima Hadiah Nobel.
Kutipan dari buku James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA Sejarah revolusi genetika
Bab 7. Genom manusia. Naskah hidup
...
Reaksi rantai polimer (PCR) ditemukan pada tahun 1983 oleh ahli biokimia Cary Mullis, yang bekerja di Cetus. Penemuan reaksi ini sangat luar biasa. Mullis kemudian mengenang: “Suatu hari pada Jumat malam di bulan April 1983, hal itu tampaknya menerangi saya. Saya sedang mengemudi, berguling-guling di sepanjang jalan gunung berliku berbulan-bulan ke California Utara, tepi hutan kayu merah. ” Sangat mengesankan bahwa dalam situasi seperti itu ia dikunjungi dengan inspirasi. Dan sama sekali tidak ada yang di California utara ada jalan khusus yang mempromosikan wawasan; hanya saja temannya pernah melihat Mullis bergegas dengan ceroboh di sepanjang jalan dua arah yang dingin dan ini sama sekali tidak mengganggunya. Seorang teman mengatakan kepada New York Times sebagai berikut: “Mullis bermimpi bahwa dia akan mati dengan menabrak sekuel. Karena itu, ia tidak takut mengemudi apa pun jika kayu merah tidak tumbuh di sepanjang jalan. ” Kehadiran sequoia di sepanjang jalan membuat Mullis berkonsentrasi dan ... ini dia, sebuah wawasan. Atas penemuannya pada tahun 1993, Mullis menerima Hadiah Nobel dalam bidang kimia dan sejak itu menjadi semakin asing dalam tindakannya. Misalnya, ia adalah pendukung teori revisionis bahwa AIDS tidak terkait dengan HIV, yang secara signifikan merusak reputasinya sendiri dan mencegah dokter.
PCR adalah reaksi yang cukup sederhana. Untuk melaksanakannya, kita membutuhkan dua primer yang disintesis secara kimiawi sebagai pelengkap ujung rantai berbeda dari fragmen DNA yang diinginkan. Primer adalah bagian pendek dari DNA untai tunggal, masing-masing panjangnya sekitar 20 pasangan basa. Keunikan primer adalah bahwa mereka sesuai dengan wilayah DNA yang ingin Anda perkuat, yaitu, templat DNA.
(Dapat diklik gambar) Cary Mullis, penemu PCRSpesifisitas PCR didasarkan pada pembentukan kompleks komplementer antara matriks dan primer, oligonukleotida sintetik pendek. Masing-masing primer saling melengkapi dengan salah satu rantai dari matriks beruntai ganda dan membatasi awal dan akhir daerah yang diamplifikasi. Bahkan, "matriks" yang dihasilkan mewakili seluruh genom, dan tujuan kami adalah untuk mengisolasi bagian-bagian yang menarik bagi kami darinya. Untuk ini, templat DNA untai ganda dipanaskan hingga 95 ° C selama beberapa menit sehingga rantai DNA tersebar. Tahap ini disebut denaturasi, karena ikatan hidrogen antara kedua rantai DNA hancur. Ketika rantai terbuka, suhunya diturunkan sehingga primer dapat menghubungi templat berantai tunggal. DNA polimerase memulai replikasi DNA dengan mengikat ke rantai nukleotida. Enzim DNA polimerase mereplikasi rantai templat menggunakan primer sebagai benih atau contoh salinan. Sebagai hasil dari siklus pertama, kami mendapatkan penggandaan ganda berurutan dari wilayah DNA tertentu. Selanjutnya kita ulangi prosedur ini. Setelah setiap siklus, kami mendapatkan area target dalam jumlah ganda. Setelah dua puluh lima siklus PCR (yaitu, dalam waktu kurang dari dua jam), kami memiliki wilayah DNA yang diminati dalam jumlah 225 kali lebih besar dari yang asli (yaitu, kami memperbesarnya sekitar 34 juta kali). Bahkan, di pintu masuk kami mendapat campuran primer, DNA templat, enzim DNA polimerase dan basa bebas A, C, G dan T, jumlah produk reaksi spesifik (dibatasi oleh primer) tumbuh secara eksponensial, dan jumlah salinan DNA "panjang" adalah linier, oleh karena itu produk reaksi mendominasi.
Amplifikasi situs DNA yang diinginkan: reaksi berantai polimerasePada awal PCR, masalah utamanya adalah sebagai berikut: setelah setiap siklus pendinginan-pendingin, DNA polimerase harus ditambahkan ke campuran reaksi, karena tidak diaktifkan pada 95 ° C. Karena itu, perlu menambahkan kembali sebelum masing-masing dari 25 siklus. Prosedur reaksi relatif tidak efektif, membutuhkan banyak waktu dan enzim polimerase, dan bahannya sangat mahal. Untungnya, Ibu Alam datang untuk menyelamatkan. Banyak hewan merasa nyaman pada suhu di atas 37 ° C. Dan mengapa angka 37 ° C menjadi penting bagi kami? Ini terjadi karena suhu ini optimal untuk E. coli, dari mana enzim polimerase untuk PCR awalnya diperoleh. Di alam, ada mikroorganisme yang proteinnya menjadi lebih tahan terhadap suhu tinggi selama jutaan tahun seleksi alam. Telah diusulkan untuk menggunakan DNA polimerase dari bakteri termofilik. Enzim ini termostabil dan mampu menahan banyak siklus reaksi. Penggunaannya memungkinkan untuk menyederhanakan dan mengotomatisasi PCR. Salah satu polimerase DNA termostabil pertama diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus yang hidup di sumber air panas Taman Nasional Yellowstone dan disebut Taq polimerase.
PCR dengan cepat menjadi pekerja keras utama proyek Genom Manusia. Secara umum, prosesnya tidak berbeda dari yang dikembangkan oleh Mullis, itu hanya otomatis. Kami tidak lagi bergantung pada kerumunan mahasiswa pascasarjana yang mata buta dengan susah payah menuangkan tetesan cairan ke dalam tabung plastik. Di laboratorium modern yang melakukan penelitian genetik molekuler, pekerjaan ini dilakukan pada robot konveyor. Robot PCR yang terlibat dalam proyek sekuensing skala besar seperti Genom Manusia bekerja tanpa henti dengan volume besar polimerase tahan panas. Beberapa ilmuwan yang bekerja dalam proyek Genom Manusia sangat marah oleh kontribusi tinggi yang tidak dapat dibenarkan bahwa pemegang paten PCR, raksasa industri dan farmasi Eropa Hoffmann-LaRoche, menambah biaya bahan habis pakai.
"Kekuatan pendorong" lainnya adalah metode sekuensing DNA itu sendiri. Dasar kimia dari metode ini pada waktu itu bukan lagi baru: Interstate Project Human Genome (HGP) mengadopsi metode cerdik yang sama yang dikembangkan Fred Senger pada pertengahan 1970-an. Inovasi dalam skala dan tingkat otomatisasi yang dicapai selama pengurutan.
Sequencing otomatis pada awalnya dikembangkan di laboratorium Lee Hood di California Institute of Technology. Dia lulus dari sekolah menengah di Montana dan bermain sepak bola Amerika sebagai striker; terima kasih kepada Hood, tim telah memenangkan kejuaraan negara bagian lebih dari sekali. Keterampilan kerja tim berguna baginya dalam karier ilmiahnya. Laboratorium Hood mempekerjakan perusahaan kimia, ahli biologi, dan insinyur yang beragam, dan tak lama kemudian laboratoriumnya menjadi pemimpin dalam inovasi teknologi.
Bahkan, metode pengurutan otomatis ditemukan oleh Lloyd Smith dan Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, yang kemudian bekerja di laboratorium Hood, menoleh ke Lloyd Smith, menawarkan kepadanya metode pengurutan yang lebih baik di mana basis masing-masing jenis akan dicat masing-masing dengan warna sendiri. Gagasan seperti itu dapat melipatgandakan efektivitas proses Senger. Sanger, ketika diurutkan dalam masing-masing dari empat tabung (sesuai dengan jumlah basa) dengan partisipasi DNA polimerase, membentuk seperangkat unik oligonukleotida dengan panjang yang berbeda, termasuk urutan primer. Selanjutnya, formamida ditambahkan ke tabung untuk memisahkan rantai dan elektroforesis gel poliakrilamida dilakukan pada empat jalur. Dalam varian Smith dan Hunkapiller, dideoxynucleotides diberi label dengan empat pewarna yang berbeda dan PCR dilakukan dalam satu tabung. Kemudian, selama elektroforesis gel poliakrilamida, sinar laser pada lokasi spesifik dalam gel menggairahkan aktivitas pewarna, dan detektor menentukan nukleotida mana yang saat ini bermigrasi melalui gel. Pada awalnya, Smith pesimis - dia takut penggunaan dosis pewarna yang sangat rendah akan menyebabkan fakta bahwa daerah nukleotida tidak bisa dibedakan. Namun, pemahaman yang sangat baik tentang teknologi laser, ia segera menemukan jalan keluar menggunakan pewarna fluorochrome khusus yang berfluoresensi di bawah aksi radiasi laser.
(Versi lengkap dengan klik - 4.08 MB) Cetakan kecil: Urutan DNA diterjemahkan menggunakan sequencer otomatis yang diperoleh dari mesin sequencing otomatis. Setiap warna memiliki satu dari empat basis.Dalam versi klasik dari metode Sanger, salah satu helai DNA yang dianalisis bertindak sebagai matriks untuk sintesis untaian komplementer oleh enzim DNA polimerase, kemudian urutan fragmen DNA diurutkan berdasarkan ukuran dalam gel. Setiap fragmen yang termasuk dalam DNA selama sintesis dan selanjutnya memungkinkan visualisasi produk reaksi ditandai dengan pewarna fluoresen yang sesuai dengan basis terminal (ini dibahas pada halaman 124); oleh karena itu, fluoresensi fragmen ini akan menjadi pengidentifikasi untuk basis yang diberikan. Kemudian tinggal melakukan deteksi dan memvisualisasikan produk reaksi. Hasilnya dianalisis menggunakan komputer dan disajikan sebagai urutan puncak multi-warna yang sesuai dengan empat nukleotida. Selanjutnya, informasi tersebut ditransmisikan secara langsung ke sistem informasi komputer, yang menghilangkan proses entri data yang menghabiskan waktu dan kadang-kadang menyakitkan, yang sangat rumit urutannya.
»Informasi lebih lanjut tentang buku ini dapat ditemukan di
situs web penerbit»
Isi»
KutipanUntuk diskon Khabrozhiteley 25% pada kupon -
PCR