Tujuan utama dari penggunaan obat-obatan yang memperlambat proses penuaan adalah untuk memperpanjang hidup yang sehat dan aktif. Yang terakhir, pada gilirannya, bertujuan untuk meningkatkan kesejahteraan ekonomi dari populasi planet yang menua dengan cepat. Agar intervensi farmakologis disetujui secara universal, obat harus efektif pada orang dewasa mana pun dan memiliki profil keamanan yang baik. Dalam artikel ini, kami menunjukkan bahwa dengan bantuan obat-obatan yang sudah dikenal oleh sains, kami dapat secara signifikan meningkatkan harapan hidup C. elegans. Peningkatan kehidupan cacing dicapai dengan mengubah aktivitas beberapa jalur pensinyalan konservatif evolusioner terkait dengan penuaan. Karena efek pada jalur sinyal yang berbeda dengan efek sinergis yang umum, kami berharap bahwa kami dapat memperlambat proses penuaan manusia, harapan hidup berlipat ganda, dan juga lebih dari dua kali lipat masa hidup yang sehat, tanpa perubahan kompensasi dalam pengembangan dan aktivitas fisik.
Sejauh yang kami tahu, harapan hidup nematoda C. elegans yang dicapai pada orang dewasa dengan narkoba adalah yang tertinggi dalam pekerjaan kami. Kami menggunakan obat-obatan yang awalnya ditujukan untuk pengobatan berbagai penyakit orang dewasa. Pengembangan metode berdasarkan penggunaan obat yang sudah disetujui yang bekerja secara simultan pada beberapa jalur pensinyalan terkait dengan penuaan dianggap sangat menjanjikan. Hal ini dapat mencegah perkembangan penyakit yang berkaitan dengan usia dan asthenia fisik dari populasi lansia di dunia, yang semakin cepat menua.
Pendahuluan
Salah satu tahap terpenting dalam ilmu penuaan adalah penemuan jalur pensinyalan evolusioner-konservatif yang bertanggung jawab untuk mengatur umur tubuh. Mutasi pada gen yang mempengaruhi jalur pensinyalan ini dapat menyebabkan perpanjangan harapan hidup dari 30 hingga 100% pada organisme model. Mutasi gen gabungan dapat menyebabkan efek sinergis yang meningkatkan masa hidup. Efek intervensi farmakologis biasanya jauh lebih lemah daripada mutasi genetik, bahkan jika mereka bertindak pada jalur pensinyalan yang sama.
Kehadiran efek sinergis dengan beberapa kelainan gen gabungan menunjukkan bahwa penggunaan obat-obatan tersebut yang secara simultan akan memengaruhi beberapa jalur pensinyalan konservatif evolusioner akan menjadi kemungkinan arah masa depan yang menjanjikan. Hingga saat ini, sedikit data yang telah dicatat tentang efek sinergis dari penggunaan obat-obatan yang ditujukan untuk meningkatkan harapan hidup. Dalam makalah ini, kami melaporkan hasil studi in vivo baru di mana obat tersebut digunakan. Kami telah menunjukkan bagaimana kombinasi obat dapat memaksimalkan efek terapi karena fakta bahwa mereka bertindak pada beberapa jalur pensinyalan, dengan saling memperkuat efek satu sama lain. Pada saat yang sama, dimungkinkan untuk meminimalkan frekuensi reaksi yang merugikan dan ¬ tingkat gangguan kompensasi dalam perkembangan tubuh, karena perubahan titik dilakukan secara terpisah tetapi berinteraksi jalur pensinyalan. Tujuan akhir dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan rejimen farmakologis untuk populasi orang dewasa, dengan efek yang terbukti pada proses penuaan, yang sama atau lebih besar dari efek mutasi.
Karena ada beberapa penanda biologis penuaan yang diakui secara umum, saat ini, untuk mengevaluasi hasil penelitian, mereka hanya membandingkan umur total organisme. Nematoda dari spesies Caenorhabditis elegans digunakan sebagai organisme model berumur pendek. Selanjutnya, kami memilih beberapa kombinasi obat, sehingga 2 kelompok obat dibuat, di mana masing-masing ada tiga obat. Seperti yang sebelumnya diterbitkan dalam penelitian, ketika menggunakan kombinasi obat ini, ada perbedaan yang signifikan dalam meningkatkan harapan hidup dan memperpanjang hidup sehat nematoda C. elegans.
Efek sinergis yang diperoleh dengan kombinasi obat ternyata sebanding dengan yang diamati setelah diarahkan mutasi pada gen terkenal yang terkait dengan penuaan. Kami tidak mengungkapkan gangguan kompensasi dalam pengembangan organisme dari yang sering ditemukan dan terkait dengan intervensi farmakologis. Kami dapat secara tidak langsung menentukan bahwa terapi obat memperlambat laju penuaan alami, karena tingkat beberapa penanda meningkat. Selain itu, kami menyimpulkan bahwa TGFβ (Transforming Growth Factor β1) adalah faktor kunci yang memberikan efek sinergis dari jalur pensinyalan. Selain itu, penelitian menunjukkan bahwa pada nematoda yang diobati dengan kombinasi obat di atas, rasio lipid tak jenuh tunggal dengan yang tak jenuh ganda mengubah sisi prevalensi yang sebelumnya (peningkatan rasio MUFA ke PUFA), dan tingkat peroksidasi lipid membran menurun. Akhirnya, kami mengkonfirmasi bahwa efek sinergis yang serupa juga ditentukan pada lalat buah spesies Drosophila melanogaster.
Hasil
Pilihan jalur pensinyalan dan target dalam C. Elegans.Berdasarkan literatur ilmiah modern, kami telah menemukan beberapa jalur pensinyalan konservatif evolusioner dan mekanisme yang berkaitan dengan penuaan (Bahan Pendukung, Tabel S1). Di antara target dan mekanisme yang kami pilih adalah: protein kinase teraktivasi AMP, c-Jun-N-terminal kinase (JNK), target mamalia rapamycin (mTOR) dan mekanisme yang terlibat dalam proses: pembatasan kalori (CR), mitogomesis (efek dosis kecil zat yang dalam dosis besar beracun) dan metabolisme mitokondria. Target dan proses di atas dianggap sebagai yang utama dalam regulasi jalur pensinyalan yang memperpanjang usia. Untuk setiap jalur pensinyalan, obat ditentukan yang pengaruhnya terhadap umur panjang dijelaskan dalam setidaknya satu dari organisme model yang diketahui (nematoda, lalat buah atau tikus).
Orang yang menguji narkoba sangat menarik bagi kami. Oleh karena itu, kami lebih suka senyawa obat dengan khasiat dinyatakan pada mamalia atau disetujui pada manusia. Awalnya, kami menemukan 11 obat potensial yang memenuhi kriteria di atas (tabel bantu S1). Kami menambahkan allantoin ke daftar kami berdasarkan pada laporan tentang kemampuannya untuk memperpanjang hidup dalam C. elegans dan hasil analisis transkripsi. Kami curiga mekanisme kerjanya berbeda dengan zat lain. Untuk menghindari kesalahan dalam mengukur harapan hidup organisme setelah penggunaan obat, kami terlebih dahulu menguji kontraktor menggunakan metode buta. Alasan utama untuk ini adalah kenyataan bahwa hasil penelitian dapat sangat bergantung pada kebenaran kondisi eksperimental dan bervariasi secara signifikan di antara berbagai laboratorium. Kami hanya menggunakan dosis obat yang sebelumnya dijelaskan dalam makalah ilmiah. Keefektifan dari lima obat yang mempengaruhi harapan hidup telah berulang kali dikonfirmasi di laboratorium kami (Gambar 1, tabel pendukung S2). Sebagai aturan, dalam penelitian kami, efektivitas senyawa yang terkait dengan peningkatan kehidupan organisme sedikit lebih rendah dari pada karya yang diterbitkan sebelumnya (Skema Pelengkap 1, tabel pendukung S2).
Fig. 1Transkrip, obat-obatan dan umur panjang
Untuk mengevaluasi efektivitas obat dalam penelitian ini, kami melakukan analisis transkriptome dan menentukan gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) dan memperkaya jalur pensinyalan sehubungan dengan kontrol. Kami memperhatikan perbedaan tertentu dalam ekspresi gen dan aktivitas jalur pensinyalan pada kelompok eksperimen, yang tidak pada kelompok kontrol. Perubahan paling signifikan dalam ekspresi gen dan jalur pensinyalan disebabkan oleh aksi satu kombinasi obat yang terdiri dari rifampisin, rapamycin, dan psora-4 (PSORA), di mana obat terakhir diberikan setelah dua yang pertama. Berbeda dengan obat yang disebutkan, metformin (MET) dan allantoin (ALLAN) memengaruhi ekspresi gen yang lebih sedikit (Skema 2a, tabel pendukung S3).
Analisis hasil transkripsional menunjukkan bahwa setiap zat obat memiliki profil unik gen yang diubahnya. Pada saat yang sama, beberapa gen ini juga ditemukan dalam profil transkripsi obat yang tersisa (Skema 2a). Dengan demikian, MET bertindak atas karya banyak gen "populer", tetapi jumlah gen unik yang terlibat sangat sedikit. Persiapan MET dan PSORA mengubah aktivitas hampir seluruh spektrum gen "populer", beberapa di antaranya juga dipengaruhi secara individual oleh obat yang ditunjukkan dalam Skema 2a.
Senyawa ALLAN memengaruhi jumlah gen terkecil, tetapi sebagian besar berasal dari kelompok yang unik. Kurang dari separuh gennya terwakili dalam spektrum transkripsi obat lain. Efek penggunaan RIF dan RAP berbeda secara signifikan dari satu sama lain dan dari obat lain. Berdasarkan tiga kriteria analisis komponen utama (PCA), kami menyimpulkan bahwa RIF, RAP, dan PSORA sangat terpisah dari sisa obat. Sebaliknya, efek ALLAN dan MET lebih bervariasi, tetapi sangat mirip. Selain itu, hasil mereka agak dekat dengan hasil kelompok kontrol.
Gbr.2Pada langkah berikutnya, kami menentukan bagaimana berbagai kombinasi obat mempengaruhi waktu hidup nematoda. Karena aksi MET dan RAP lebih mudah ditransfer ke manusia, kami mempelajari obat ini sejak awal. Namun, ternyata kombinasi MET dan RAP pada dosis optimal 50 mg dan 100 mg tidak mengarah pada perpanjangan hidup yang lebih lama (Skema Tambahan 2 J, P). Kami melakukan beberapa penelitian lagi menggunakan semua kemungkinan kombinasi obat ini dalam dosis optimal dan semi-optimal (Skema Tambahan 2 JP).
Penggunaan MET dan RAP dalam dosis semi-optimalnya menghasilkan peningkatan masa hidup maksimum nematoda (Skema 2e, Skema Tambahan 2 m, s), tetapi bukan harapan hidup rata-rata (Skema Tambahan, 2p). Keuntungan kecil dari MET dan RAP ini konsisten dengan temuan penelitian lain pada tikus. Ini membuktikan bahwa penambahan MET ke RAP terutama memperpanjang umur laki-laki, dan pada wanita, hasilnya hampir tidak terlihat (ketika direkam sama sekali).
Selanjutnya, kami secara berurutan menemukan efek dari 10 kombinasi obat. Dalam setiap kombinasi obat, ada dua dari lima obat yang mungkin (Skema Tambahan 2 ai). Analisis efek sinergis dilakukan dengan menggunakan model HSA (model Aktivitas Tinggi Tunggal), yang memperkirakan tingkat aktivitas salah satu dari dua obat.
Hasil dari penggunaan kombinasi berbagai obat dianggap sinergis, asalkan itu sangat melebihi hasil yang diperoleh dari aksi masing-masing obat secara terpisah dan ketika dosis obat itu sama. Dengan definisi di atas, kami menemukan bahwa hanya dua dari sepuluh kombinasi obat yang memiliki efek sinergis (Skema 2c, d, Skema Tambahan 2 dan Tabel Pendukung S2), difiksasi dengan kombinasi obat: RIF dengan RAP dan RIF dengan PSORA. Tiga kombinasi obat yang berbeda dapat dibuat dengan obat ini, tetapi hanya dua di antaranya yang paling berbeda satu sama lain menurut analisis PCA. Itu dalam dua terakhir bahwa efek sinergis terungkap (Skema 2b, skema tambahan 4a, b).
Di antara 8 pasangan obat yang tersisa, efek pada harapan hidup pada 4 adalah sama dengan obat yang paling efektif dalam kombinasi obat yang sesuai. Dalam 4 kombinasi lain, efek dari satu obat yang saling mengecualikan efek dari yang lain. Dalam kasus terakhir, tidak adanya reaksi toksik dan peningkatan masa hidup juga dicatat (Skema 2 Tambahan, tabel pendukung S2).
Dalam penelitian kami, penggunaan dua kombinasi obat dengan efek sinergis menyebabkan perpanjangan hidup yang lebih signifikan, dibandingkan dengan data yang diterbitkan sebelumnya dalam literatur ilmiah. Namun, peningkatan harapan hidup setelah penggunaan narkoba kurang dari efek yang sama dari gangguan mutasi. Dalam hal ini, kami memiliki pertanyaan: apakah tingkat kelangsungan hidup yang sesungguhnya adalah maksimum yang dapat dicapai dengan perawatan obat pada hewan dewasa? Apakah kita akan mendapatkan peningkatan umur tambahan dengan menambahkan senyawa lain? Jika kombinasi obat mencakup tiga senyawa obat, maka jumlah kemungkinan kombinasi meningkat menjadi 30. Kami tidak memiliki kesempatan untuk memeriksa sejumlah kombinasi obat tersebut.
Oleh karena itu, kami secara selektif mempelajari efek dari beberapa kombinasi tiga obat. Pertama-tama, kami mempertimbangkan kombinasi obat di mana ketiga senyawa obat paling berbeda satu sama lain berdasarkan kriteria metode PCA. Kondisi lain adalah adanya efek sinergis dari obat ketika digunakan bersama dengan obat lain (RAP, RIF dan PSORA). Namun, harapan hidup nematoda ketika menggunakan kombinasi dari tiga obat lebih buruk daripada ketika menggunakan kombinasi obat ganda (Skema Tambahan 3a, tabel pendukung S2). Kemudian kami menguji efektivitas kombinasi tiga obat, yang termasuk obat ALLAN dengan profil unik gen yang terlibat (busur oranye terang, skema 2a).
Profil aktivitas gen ALLAN tidak cocok dengan profil gen aktif obat lain. Ini juga berbeda dari spektrum transkriptome mutan eat-2. Dengan demikian, kami berhipotesis bahwa senyawa ALLAN memiliki mekanisme aksi yang unik dan, karenanya, menambahkannya ke dua pasangan kombinasi yang menunjukkan efek sinergis. Dalam kedua kasus, peningkatan yang signifikan secara statistik dalam harapan hidup rata-rata dan maksimum diamati (Skema 2f, g, skema tambahan 3d-f dan tabel tambahan s2). Hasil terbaik adalah kombinasi dari tiga obat: RAP, RIF dan ALLAN, yang mana rata-rata waktu hidup cacing menjadi dua kali lipat, dan median dan maksimum masing-masing mencapai 44 dan 50 hari (Auxiliary table s2). Efek yang dihasilkan sebanding dengan efek gangguan mutasi. Menurut informasi kami, perpanjangan masa hidup C. elegans ini ternyata menjadi yang terbesar yang pernah diterbitkan dalam literatur ilmiah ketika menggunakan obat yang digunakan pada orang dewasa.
Mekanisme sinergi obat
Daf-16 / FOXO adalah faktor transkripsi yang memainkan peran kunci dalam mengatur umur organisme model, dan mungkin juga manusia. Untuk mempelajari mekanisme aksi sinergis dari kombinasi obat yang kami identifikasi, kami menentukan efektivitasnya ketika cacing memiliki mutasi yang negatif pada jalur pensinyalan Daf-16. Efek obat-obatan seperti RAP atau ALLAN, diambil secara terpisah, tidak tergantung pada jalur pensinyalan Daf-16. Sebagai perbandingan, perpanjangan harapan hidup menggunakan RIF sepenuhnya karena pekerjaan jalur Daf-16, dan PSORA sebagian (Skema 3a, skema tambahan 8).
Kombinasi sinergis dari obat RAP + RIF termasuk satu obat RIF, yang efeknya sepenuhnya tergantung pada jalur Daf-16, dan obat RAP lain dengan efek independen dari jalur pensinyalan ini. Dengan penggunaan kombinasi persiapan RIF + PSORA, efek sinergis juga dicatat, terlepas dari kenyataan bahwa aktivitas obat dikaitkan dengan fungsi jalur Daf-16, dan nematoda memiliki gen Daf-16 mutan (Skema 3a, Skema 8 tambahan).
Hasil seperti itu tidak terduga, karena ternyata efek sinergis tidak hanya disebabkan oleh jalur Daf-16: efek ini dicapai dalam mutan cacing gen Daf-16 yang menggunakan obat-obatan yang tindakannya sepenuhnya atau sebagian bergantung pada fungsi gen ini.
Gbr.3Menurut berbagai penulis, beberapa obat yang kami uji adalah mimetik CR (pembatasan kalori) yaitu: zat obat yang mirip dengan senyawa yang disintesis secara alami dalam tubuh, bertanggung jawab untuk penurunan nafsu makan. Kami menggunakan model makan-2 mutan C. elegans untuk mengetahui apakah kombinasi obat dan obat sinergistik mereka mempengaruhi jalur pensinyalan CR. Hanya senyawa RIF yang memperpanjang umur nematoda mutan-2. Oleh karena itu, semua yang lain kecuali persiapan RIF milik mimetik CR.
Jadi, dalam dua kombinasi obat, RAP + RIF dan RIF + PSORA, satu senyawa milik CR mimetik, dan efek yang lain tidak tergantung pada mutasi makan-2. Penggunaan gabungan RIF dan PSORA menyebabkan peningkatan umur nematoda, sedangkan penambahan ALLAN pada kombinasi obat ini tidak berpengaruh pada peningkatan umur cacing. Kami percaya bahwa pola ini disebabkan oleh fakta bahwa dalam kombinasi obat ini ALLAN adalah mimesis CR kedua.Untuk mempelajari lebih lanjut mekanisme sinergi obat, kami membuat profil transkriptome dari kombinasi obat dengan efek sinergis dan kombinasi obat tanpa efek seperti itu. Nematoda diberi satu, dua atau tiga senyawa obat untuk mendeteksi ada atau tidaknya efek ini. Transkrip obat individu yang ditugaskan untuk CR - mimetik dikelompokkan di wilayah yang sama dengan profil transkriptom dari organisme mutan makan-2. Sebaliknya, senyawa RIF tidak memiliki aktivitas mimetik CR - dan transkripnya berbeda dari hasil analisis transkripsional mutan eat-2 dan obat lain (Skema 2h).Sangat menarik untuk dicatat bahwa transkriptom kombinasi obat dengan efek sinergis yang dikelompokkan bersama dan pola ekspresi gen mereka berbeda baik dari ekspresi obat individu yang termasuk dalam kombinasi dan dari mutan makan-2 (Skema 2h, skema tambahan 4 c, d). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, ketika menggunakan kombinasi obat sinergis ganda dan tiga, jalur pensinyalan TFGβ sering disajikan (Skema 4a, skema tambahan 6c, 7a, tabel tambahan s4). Selain itu, kami membandingkan dengan transkrip kombinasi obat dengan transkrip senyawa obat yang termasuk di dalamnya, yang terakhir dalam kasus ini berfungsi sebagai kelompok kontrol (lihat metode). Berbeda dengan kelompok kontrol, kombinasi obat dengan efek sinergis meningkatkan aktivitas TGFβ dan beberapa jalur pensinyalan lainnya.Dalam kombinasi obat tanpa tindakan sinergis, jalur tersebut tidak terwakili dalam profil transkripsi (Auxiliary table s5).Beberapa kombinasi obat memperpanjang usia makan-2 hingga nematoda mutan, tetapi tidak ada obat individu dalam kombinasi ini. Kami memutuskan untuk memeriksa apakah makan mutan-2 akan meningkatkan aktivitas jalur TGFβ setelah kombinasi sinergis, berbeda dengan cacing makan-2 tanpa terapi obat. Satu-satunya jalur pensinyalan yang secara nyata hadir dalam transkrip setelah menggunakan kombinasi obat sinergis adalah jalur TGFβ (Skema Tambahan 7b, tabel pendukung S6). Sangat mengejutkan bagi kami bahwa jalur ini secara eksklusif ditentukan oleh aksi kombinasi sinergis senyawa obat (Skema 4b, skema tambahan 7a, c, tabel tambahan s7).
Fig. 4Signifikansi jalur pensinyalan TGFβ untuk sinergi obat
Aktivasi jalur pensinyalan TGFβ yang terungkap dalam penelitian kami mungkin merupakan mekanisme utama di mana efek sinergis direalisasikan yang memperpanjang umur organisme model. Sebelumnya, penelitian mencatat bahwa mutasi TGF (daf-7) menyebabkan peningkatan waktu hidup melalui jalur pensinyalan insulin. Kedua mediator daf-2 dan daf-7 juga mengatur transkripsi gen yang bergantung pada daf-16 (Skema Tambahan 7d). Kami bertanya-tanya apakah mungkin, dengan bantuan kombinasi obat yang dipilih, untuk memperpanjang umur mutan daf-2, meskipun kenyataan bahwa harapan hidup hewan akibat mutasi ini sudah lebih tinggi. Untuk mulai dengan, kami menentukan masa hidup nematoda bermutasi daf-2 setelah setiap kombinasi obat.Peningkatan seumur hidup dicatat dalam kombinasi yang mengandung RAP: RAP + RIF dan RAP + RIF + ALLAN. Namun, tingkat pertumbuhannya hampir sama dengan ketika hanya menggunakan obat RAP. Efek sinergis yang memperpanjang umur nematoda tidak diamati dalam kombinasi obat apa pun (Skema 3c, Skema 8 tambahan, tabel tambahan s2). Tindakan PSORA juga berkontribusi pada peningkatan umur cacing mutan daf-2, tetapi kombinasi obat termasuk obat ini (RIF + PSORA dan RIF + PSORA + ALLAN) memiliki efek netral pada umur panjang nematoda (Skema 3c dan skema tambahan 8).Di masa depan, kami menguji efektivitas semua kombinasi obat sinergis dan zat obat yang mereka terdiri atas mutan daf-7. Dalam kasus tidak ada efek sinergis terdeteksi. Kami sampai pada kesimpulan bahwa sinergi obat adalah karena jalur pensinyalan daf-7, meskipun dalam kondisi ini, obat-obatan individual dari kombinasi tersebut efektif dalam hal meningkatkan harapan hidup (Skema 3d, Skema 8 tambahan).Sinergi Narkoba, MUFA, dan Life Span
Seperti yang dilaporkan sebelumnya dalam penelitian, penataan ulang metabolik terjadi pada garis nematoda mutan umur 1 dan daf-2 yang berumur panjang, menghasilkan peningkatan produksi dan akumulasi lemak. Selain itu, jalur TGFβ / daf-7 mengatur metabolisme triasilgliserol (TAG) dan diketahui bahwa nematoda daf-7 mutan menyimpan lebih banyak lemak. Informasi ini dan data pekerjaan kami mendorong kami untuk mempelajari apakah kombinasi obat yang ditandai oleh sinergisme mempengaruhi profil lipid nematoda dengan jalur pensinyalan yang diblokir TGFβ (Auxiliary table s3).Pada tahap awal, kami membuat analisis transkriptome dari hasil kami untuk menemukan jalur pensinyalan yang mengubah komposisi lipid, dan menemukan bahwa kombinasi obat dengan efek sinergis meningkatkan tingkat SREBP-1c: sbp-1 homolog dalam C. elegans. Ini berfungsi sebagai faktor transkripsi utama yang mengontrol gen yang bertanggung jawab untuk sintesis berbagai enzim lipid dan desaturase. Yang terakhir terlibat dalam pembentukan asam lemak tak jenuh tunggal (MUFA) (Skema 4c, f). Selanjutnya, kami melakukan analisis lipidome dengan spektrometri massa untuk mendeteksi perubahan profil lipid setelah terpapar obat. Dalam nematoda, setelah penggunaan kombinasi obat sinergis, cadangan TAG, rasio MUFA: PUFA (asam lemak tak jenuh tunggal terhadap tak jenuh ganda) dan jumlah 16: 1 dan 19 meningkat secara signifikan:1 asam lemak tak jenuh tunggal (MUFAs) (Skema 4f).Akibatnya, penurunan indeks ikatan rangkap (DBI) (menunjukkan tingkat ketidakjenuhan asam lemak) dan indeks peroksidasi lipid (PI) diamati (Skema 4i). PI yang rendah menunjukkan bahwa lipid mengandung ikatan rangkap yang lebih sedikit di antara karbon, sehingga mengurangi kemampuan lipid untuk mengalami peroksidasi. Menurut hasil dari berbagai penulis, penurunan kemampuan peroksidasi dikaitkan dengan peningkatan harapan hidup, mungkin karena lipid kurang rentan terhadap oksidasi dalam tubuh.Dipercayai bahwa dengan menekan proses peroksidasi, resistensi terhadap stres oksidatif meningkat. Dalam pekerjaan kami, pada cacing setelah penerapan kombinasi obat sinergis, memang, resistensi tersebut meningkat (Skema 5 e, f). Selain itu, kami mencatat peningkatan tingkat umum sphingomyelin pada nematoda (Skema 4 jam). Para ilmuwan telah menunjukkan bahwa indikator ini menyebabkan peningkatan umur cacing melalui peningkatan autophagy.
Gbr.5Penekanan metabolisme energi dan menghalangi kerja rantai membran transpor elektron (ETC) dapat memperpanjang umur C. elegans. Fakta ini tidak menjelaskan hasil dalam penelitian kami, karena tidak mungkin bagi nematoda untuk mendeteksi penurunan yang nyata dalam laju metabolisme basal (Skema 5i). Literatur ilmiah menggambarkan bahwa umur panjang paling sering disertai dengan faktor-faktor seperti: perlambatan pertumbuhan dan perkembangan, serta penurunan kesuburan. Kami tidak menemukan bahwa pada cacing yang diberi kombinasi obat sinergis yang berbeda, durasi masa dewasa dan kesuburan umum berubah secara signifikan. Meskipun, setelah menambahkan kombinasi ini, sedikit peningkatan periode reproduksi nematoda dicatat (Skema 5a-c, Skema 9a tambahan).Pada tahap berikutnya, kami menentukan: indikator adaptasi, tingkat toleransi situasi stres dan kelangsungan hidup nematoda. Kami mengevaluasi kecepatan gerakan spontan, ketahanan terhadap sengatan panas, ketahanan terhadap stres oksidatif, dan juga menghitung viabilitas cacing pada skala mobilitas spontan, dihitung dengan metode Herdon (Herndon). Pada kelompok kontrol, masa hidup aktif adalah sekitar 50% dari total masa hidup nematoda. Indikator serupa pada cacing yang diobati dengan preparat RIF + PSORA + ALLAN atau RAP + RIF + ALLAN masing-masing mencapai 57% dan 63% dari umur yang diperpanjang (Skema 5d, data tambahan 9c). Dengan demikian, masa hidup absolut dan periode relatif aktivitas aktif nematoda meningkat secara signifikan.Kami mengamati bahwa ketika cacing terakhir mati pada kelompok kontrol, di cacing lainnya, lebih dari separuh individu menunjukkan tingkat aktivitas vital yang optimal (Skema 5d, data tambahan 9c). Analisis gerakan spontan menunjukkan bahwa pada kelompok eksperimen, terlepas dari usia cacing, mobilitas mereka setelah aksi kombinasi obat seperti: RIF + PSORA + ALLAN atau RAP + RIF + ALLAN secara signifikan lebih tinggi daripada nematoda pada kelompok kontrol. Memang, mobilitas spontan dari orang tua (18 hari kehidupan) di mana obat digunakan tidak berbeda dari aktivitas motorik cacing muda (7 hari hidup) pada kelompok kontrol (Skema 5g). Selain itu, terapi obat cacing meningkatkan resistensi terhadap panas dan stres oksidatif (analisis toksikologis, skema 5e, f, skema tambahan 9b).Pengamatan kami menunjukkan bahwa setelah aksi kombinasi obat sinergis, nematoda memperpanjang periode kehidupan aktif, meningkatkan resistensi terhadap faktor stres dan, bahkan, mobilitas individu, sementara perubahan kompensasi dalam perkembangan fisiologis mereka tidak ada atau minimal.Mengingat hasil ini, kami ragu bahwa peningkatan harapan hidup disebabkan oleh penurunan laju penuaan biologis. Tingkat penuaan dapat dinyatakan sebagai indikator waktu di mana kematian individu berlipat ganda (MRDT atau waktu menggandakan intensitas kematian). Menggunakan platform analitik Survcurv, kami menentukan parameter ini dalam organisme model setelah menerapkan kombinasi obat sinergis. Dengan efek gabungan dari persiapan RIF + PSORA + ALLAN, tingkat nematoda MRDT secara signifikan lebih tinggi daripada indikator yang sama pada kelompok kontrol (MRDT = 3,7 dan 3 hari, masing-masing P <0,0001).Tingkat kematian cacing muda (IMR) pada kelompok eksperimen juga secara signifikan lebih rendah (IMR dari kelompok kontrol = 2.7e-3, IMR di bawah aksi RIF + PSORA + ALLAN = 8.5e-4, RAP + RIF + ALLAN = 9.3e-4, P <0,001). Kami menyimpulkan bahwa melalui penggunaan kombinasi obat sinergis, proses penuaan nematoda melambat dan resistensi terhadap berbagai faktor negatif pada individu muda meningkat, yang pada akhirnya menyebabkan perpanjangan hidup mereka.Pelestarian efek sinergisme obat pada lalat Drosophila
Salah satu masalah utama dalam meneliti proses penuaan adalah pertanyaan mentransfer hasil yang dicapai dari memperpanjang hidup dari satu spesies ke spesies lain. Untuk alasan ini, kami mempelajari apakah efek sinergi obat yang memperpanjang umur C. elegans akan dipertahankan dalam percobaan pada Drosophila melanogaster. Sebelumnya, dalam studi, para ilmuwan menunjukkan bahwa RAP meningkatkan kehidupan lalat buah, sementara MET tidak efektif. Kami telah secara konsisten mengevaluasi efek persiapan individu dan kombinasinya pada umur lalat buah jantan. Pada awalnya, kami menunjukkan bahwa senyawa obat RAP dan ALLAN memperpanjang usia rata-rata lalat buah, sementara RIF dan PSORA hanya meningkatkan harapan hidup maksimum organisme (Skema 6, tabel pendukung s2).Efek sinergis yang memperpanjang umur lalat terungkap dalam kombinasi obat berdasarkan senyawa RAP: RAP + RIF dan RAP + RIF + ALLAN (Skema 6a). Kami tidak menemukan peningkatan waktu hidup rata-rata lalat ketika menggunakan kombinasi obat yang mengandung PSORA: RIF + PSORA dan RIF + PSORA + ALLAN (Skema 6b). Namun, dibandingkan dengan hasil aksi obat individu, kombinasi obat RIF + PSORA menyebabkan efek sinergis yang meningkatkan masa hidup maksimum organisme (Skema 6c). Karena lalat buah Drosophila melanogaster mempertahankan efek sinergi obat, kami percaya bahwa hasil kerja kami mengkonfirmasi keberadaan mekanisme konservatif evolusioner yang menentukan berfungsinya efek sinergis ini.
Gbr.6Diskusi
Dalam karya ini, kami dapat menemukan beberapa kombinasi obat dengan efek sinergis. Mereka secara selektif memengaruhi jalur pensinyalan tertentu yang terkait dengan penuaan dan umur panjang. Selain itu, jalur pensinyalan dapat saling berpotongan. Meskipun kombinasi obat tersebut hanya digunakan di masa dewasa, masa hidup aktif C.elegans menjadi dua kali lipat. Ukuran efek intervensi obat sebanding dengan efek setelah mutasi klasik yang memperlambat penuaan. Sejauh yang kita tahu, penelitian ini telah menjadi yang terbesar dalam hal jumlah dan volume intervensi obat pada hewan dewasa.
Ketika menggunakan kombinasi obat sinergis yang meningkatkan masa hidup cacing, kami tidak dapat mendeteksi gangguan kompensasi negatif yang terjadi bersamaan atau gangguan dalam perkembangan hewan. Gangguan serupa telah diamati pada organisme dengan mutasi pada gen yang terkait dengan penuaan. Juga, efek obat positif yang dicatat bukan karena penurunan pekerjaan rantai membran transportasi elektron (ETC) atau penghambatan metabolisme pada cacing. Indikator-indikator ini dievaluasi berdasarkan tingkat konsumsi oksigen.
Memang, hewan yang menerima kombinasi obat melebihi kelompok kontrol organisme dalam hal aktivitas motorik. Bentuk dan aktivitas fisik adalah sama pada individu yang lebih tua dalam kelompok eksperimen dan pada yang lebih muda pada kelompok kontrol (Skema 5g). Analisis mortalitas menunjukkan bahwa efek sinergis dari kombinasi obat memperlambat laju penuaan biologis sekitar 20% (Skema 10 tambahan). Untuk menguji efek positif sinergisme obat dan konservatisme evolusionernya, kami melakukan beberapa percobaan pada lalat buah Drosophila melanogaster. Dua dari empat kombinasi obat mengkonfirmasi keamanan efek sinergis.
Secara evolusi, nematoda lebih dekat dengan mamalia daripada lalat. Oleh karena itu, mekanisme konservatif dan jalur pensinyalan pada lalat buah dan nematoda adalah kuno. Mungkin, awalnya mekanisme aksi sinergis ada pada nenek moyang yang sama dengan ketiga kelas hewan ini.
Untuk mempelajari mekanisme aksi sinergi obat yang memperpanjang umur cacing, kami melakukan beberapa percobaan epistasis (Epistasis-supresi aksi pasangan gen alel oleh genom pasangan non-alel) dan analisis transkriptome. Hasilnya, kami dapat menemukan bahwa jalur pensinyalan daf-2 / daf-16 (IGF / FOXO) dan TGF (daf-7) memainkan peran penting dalam fungsi efek sinergis (Skema 4j). Hubungan antara kedua jalur ini juga telah dikonfirmasi dalam penelitian lain. Penulis mereka melaporkan bahwa daf-7 mengatur masa hidup hewan melalui jalur pensinyalan insulin, dan jalur TGF saraf dikaitkan dengan asupan nutrisi dan umur panjang. Selain itu, daf-7 mengendalikan metabolisme C. elegans dan proses penyimpanan lemak. Mutasi yang memperpanjang umur C. elegans bertindak pada metabolisme lipid cacing dengan meningkatkan jumlah lipid tak jenuh tunggal dan mengurangi jumlah lipid tak jenuh ganda.
Hasil ini konsisten dengan temuan penelitian kami. Sinergi obat meningkatkan tingkat faktor transkripsi utama sbp-1, yang memengaruhi metabolisme lipid dan sintesis lipid tak jenuh tunggal (Skema 4c, f, skema tambahan 5). Analisis spektral massa dari nematoda lipidoma, di mana berbagai kombinasi obat dengan efek sinergis digunakan, mengungkapkan perubahan dalam metabolisme lemak: aktivasi faktor sbp-1, akumulasi triasilgliserol dan peningkatan rasio lipid mono dan poli tak jenuh ganda dalam arah peningkatan yang sebelumnya (termasuk dalam dua kelas lipid - phosphatidylcholine dan phosphatidylethanolamine). Akhirnya, dalam literatur ilmiah dijelaskan bahwa dominasi lipid tak jenuh tunggal daripada tak jenuh ganda ditemukan dalam profil lipid membran eritrosit anak-anak yang orang tuanya bertahan 90 tahun atau lebih.
Ada minat besar di antara para ilmuwan di dunia tentang potensi kemampuan MET dan, mungkin, senyawa RAP, untuk memperlambat perkembangan gangguan terkait usia dan mencegah penyakit manusia. Mengingat meningkatnya perhatian terhadap masalah ini, kami ingin menyebutkan eksperimen di mana efektivitas kombinasi persiapan MET dan RAP pada C. elegans dan tikus lemah. Hasil seperti itu mengecewakan banyak ilmuwan.
Dalam pekerjaan kami, kami menunjukkan bahwa harapan hidup ditentukan oleh kompleks jalur pensinyalan dan interaksi gen dan molekul biokimia. Pengaruh simultan dari jalur pensinyalan tertentu pada beberapa target dapat menyebabkan efek positif yang nyata dan terkadang hasil yang tidak terduga. Dalam penelitian ini, berdasarkan prinsip bukti, kami menggunakan obat yang bertindak pada jalur pensinyalan kunci.
Tiba-tiba, kami menemukan efek sinergis, yang bersifat universal dan evolusioner secara konservatif. Hasil penelitian kami mengkonfirmasi validitas penggunaan obat yang memperlambat aktivitas banyak jalur pensinyalan konservatif sekaligus untuk memperlambat laju penuaan biologis. Jika para ilmuwan berhasil mentransfer prinsip tindakan ini kepada orang-orang, ini akan secara signifikan meningkatkan efektivitas perawatan medis dan kesejahteraan ekonomi masyarakat.
Terjemahan: Tatyana Gneteeva.