Geeks de genotipagem: experiência em genética de campo

Tínhamos quatro centrífugas, mil pipetas de Pasteur, kits de reagentes, um freezer com menos vinte, um termociclador, uma câmara de abandono e um transiluminador que ligava apenas se você pressionar. A única coisa que levantou dúvidas foi como faremos a PCR no campo, mas sabíamos que mais cedo ou mais tarde tentaríamos isso.

Fizemos isso pela primeira vez no Moscow GikPiknik de 13 a 14 de junho no parque Krasnaya Presnya. Montamos mesas, plantamos voluntários, soldamos gel de agarose no microondas do nosso escritório (recebemos belos briquetes de eletroforese, transparentes como uma lágrima de bebê) e começamos a genotipagem. Eu queria mostrar a todos que a genética é divertida!



Equipe Atlasfez genotipagem de DRD4, o gene do receptor da dopamina conhecido como hormônio do prazer. O gene DRD4 é responsável por fazer com que nossas células cerebrais “sintam” a presença de dopamina. O fim deste gene é formado pela repetição de sites. O número de repetições pode ser diferente - de 2 a 11. Os alelos: 2R, 4R, 7R etc. serão numerados de acordo. Dependendo do número de repetições no gene, a proteína responderá mais ou menos à dopamina. Isso afeta a intensidade da sensação de prazer de eventos ou comida e, como conseqüência, o nível de excitação de uma pessoa. Pessoas com repetição de sete vezes (polimorfismo 7R) precisam de mais dopamina para obter satisfação, é improvável que tenham doces suficientes ou prazeres simples semelhantes. Muitas vezes eles têm que viajar para isso,pratique esportes arriscados - eles não ficam quietos. Isto é confirmado porestudos que identificaram uma relação entre o alelo 7R e a distância da migração de povos antigos da África para a Eurásia.

Para determinar o polimorfismo, foi necessário isolar o DNA, realizar uma reação em cadeia da polimerase (PCR) e executar seus resultados na eletroforese: organizar os segmentos do gene DRD4 em geléia de agarose. Mas as primeiras coisas primeiro.
Na fase de extração de DNA da saliva, todos poderiam participar. Primeiro você tinha que fazer uma raspagem na parte interna da bochecha com um cotonete e enxaguar em um tubo de ensaio com água.
Depois rolamos o tubo em uma centrífuga e, sob a ação da força centrífuga, as células epiteliais se assentaram e formaram um precipitado. Despejamos água e adicionamos um tampão de lise (detergente) ao tubo de ensaio para destruir as paredes das células e aquecê-lo em banho-maria.

Como resultado, no tubo de ensaio, em vez de células inteiras, há um smoothie, como o de um liquidificador: os restos de membranas, o citoplasma com as proteínas dissolvidas nele, organelas celulares e DNA. Nós o removemos em três etapas.
O primeiro estágio é baseado na polaridade. Todas as moléculas são divididas em dois grupos - polares (isto é, tendo uma carga) e não polares (sem nenhuma carga na superfície). Moléculas polares como solventes polares (como o sal se dissolve na água) e moléculas não polares se dissolvem apenas em líquidos não polares (óleos essenciais - em álcool).



Portanto, adicionamos um solvente não polar ao clorofórmio no tubo de ensaio (o DNA não se dissolve nele e as membranas celulares - sim) e o enviamos para centrifugação.
Como resultado, obtemos uma solução bifásica: água com um filme de DNA no topo e clorofórmio que caiu no fundo. É necessário desenhar cuidadosamente a parte aquosa com DNA com uma pipeta Pasteur e transferir para outro tubo e despejar clorofórmio. Para honra dos nerds, dizemos que até os mais jovens se aventuraram a realizar essa operação de joalheria.
Em seguida, adicionamos uma solução de sedimentos para lavar novamente o DNA dos detergentes.
Como o DNA é uma partícula carregada, adicionamos uma solução salina com alta força iônica para precipitá-la. (Em algum momento, acabou com a gente, eu tive que correr para a praça de alimentação, tomar sal comum e criá-lo). No final da terapia de choque: adicione 96% de etanol gelado. Dez minutos no freezer, dez mil círculos em uma centrífuga - e podemos ver o DNA no fundo do tubo.
Drenamos o líquido e o próprio precipitado é dissolvido em água deionizada. Essa água não atrapalha o funcionamento das enzimas usadas na biologia molecular e, portanto, pode ser usada para PCR.

Todo o resto ocorreu em nossa barraca de laboratório (leia-se em campo aberto).



Usando PCR, obtivemos muitas cópias do site no final de nosso gene.
Dois iniciadores determinaram o início e o fim das repetições do gene DRD4. Eles o cortaram e copiaram muitas vezes usando a enzima polimerase, que reproduz a sequência de nucleotídeos na imagem e semelhança do segmento gênico originalmente existente. Esse processo é chamado de amplificação. Tudo isso aconteceu automaticamente em um amplificador especial.

Para determinar o polimorfismo, realizamos eletroforese - as mesmas raças de que já falamos. Nossa especialista em biologia molecular Vera Bashmakova pingou amostras obtidas após PCR nos poços do gel de agarose.



Então uma corrente elétrica foi passada através do gel. Moléculas de DNA carregadas se moviam em um campo elétrico, e a velocidade de seu movimento dependia do número de repetições no gene: quanto mais houver, mais lento será o comprimento do DNA. Adicionamos uma solução especial ao gel, que destacou o DNA se o gel fosse exposto à luz ultravioleta em um transiluminador. A distância foi medida com um marcador de peso molecular - e pronto, você determinou o alelo 7R "lento" e aventureiro.



Toda a análise levou cerca de duas horas (excluindo o processo de extração de DNA).

Em apenas dois dias do piquenique, cerca de 150 pessoas passaram na genotipagem, das quais 13% eram aventureiras genéticas. Ao mesmo tempo, em média para a população russa, a variante 7R é encontrada em apenas 5% das pessoas . Acontece que a concentração de aventureiros genéticos no HikPiknik aumentou.

A propósito, um dos aventureiros de sábado estava tão empolgado com a genética de campo que ele veio a nós no domingo como voluntário.

UPD : e em São Petersburgo, a concentração de aventureiros genéticos é menor: apenas 2,5%.
No total, durante o segundo final de semana de Gikpiknik em São Petersburgo, progenotipamos 160 pessoas.

Source: https://habr.com/ru/post/pt380615/