Engenharia genética de bactérias: como obter a proteína que precisamos das bactérias

Assim, em dois artigos anteriores sobre engenharia genética de bactérias ( uma e duas vezes ), descobrimos como coletar os genes de que precisamos, de que forma eles podem ser introduzidos na bactéria e como exatamente eles podem ser introduzidos nela. Suponha que fizemos todas essas manipulações para fazer uma biofábrica para a produção de proteínas. Agora, agora é a pequena empresa - obter nossa proteína da bactéria em sua forma mais pura.
Existem muitos métodos para resolver esse problema, a maioria deles relacionada à cromatografia. Leia como esses métodos funcionam sob o gato.

A fase estacionária “captura” as moléculas que passam pelos seus grupos (-OH).

Então, conseguimos a tensão necessária e aumentamos a biomassa. Agora precisamos remover nossa proteína de alguma forma.

Primeiro de tudo, pegamos nossa cultura e a colocamos em garrafas de centrífuga. As bactérias são objetos bastante grandes e pesados, portanto, para precipitá-las, valores monstruosos de sobrecarga não são necessários durante a centrifugação: 10000g serão mais que suficientes por 20 minutos. Como resultado, obtemos um sedimento no fundo das garrafas e um líquido (é chamado sobrenadante). Despejamos o líquido, já que nossa proteína está nas bactérias que estão nos sedimentos. Você pode prosseguir de acordo com as circunstâncias: trabalhe imediatamente com o precipitado obtido ou congele e armazene até que seja necessário. Pode ser armazenado por muito tempo. O procedimento adicional para trabalhar com lodo não depende se o armazenamos no freezer ou não.

Digamos que é hora de trabalhar com sedimentos. O que vem a seguir?

Primeiro de tudo, precisamos destruir as células para que a proteína possa sair. Para fazer isso, use os seguintes métodos:

• Congelamento e descongelamento seqüenciais. Não é a ferramenta mais eficaz para a destruição da membrana celular, mas é segura para proteínas, geralmente começa com vários desses ciclos e depois passa para métodos mais eficazes;
  
• Tratamento por ultrassom (sonicação). O método é amplamente utilizado, é simples e eficaz. Geralmente, o ultrassom é entregue diretamente ao volume de água usando um "alto-falante" alongado que é inserido no fluido com as células, de modo que o final do "alto-falante" quase chegue ao fundo. Este é um método bastante difícil. Há também uma alternativa mais suave - o ultrassom é alimentado no banho de água no qual os tubos estão flutuando.
  
  
  
  
  Um graduado do MIT adverte - observe seus sonadores com cuidado.
  
  Ao realizar a destruição ultrassônica de células, é importante monitorar a temperatura: a água aquece rapidamente sob a influência do ultrassom, e não precisamos desnaturar nossa proteína, e não gostaríamos de fervê-la. Portanto, no primeiro caso (com uma “coluna alongada”), o tubo de teste com células é inserido em um copo com gelo e água, e deve haver muito gelo. A água, neste caso, atua como uma interface térmica entre o gelo e o tubo de ensaio resfriado por ele. No caso da “alternativa macia”, o gelo é adicionado diretamente ao banho-maria.
  
  
  Demonstração de processamento ultrassônico "rígido". Preste atenção ao barulho terrível próximo à instalação, é especialmente bem ouvido às 2:06 deste vídeo. Alguém é salvo da melhor maneira possível: alguém tenta sair da sala durante a sonicação, alguém usa fones de ouvido especiais que absorvem ruído.
  
  
  Demonstração de tratamento ultrassônico "suave".
  
• Adicionando agentes lisantes ao meio. Estes são principalmente detergentes, ou seja, "sabão" (em geral, a palavra "detergente" em inglês significa "detergente"). Os detergentes estão essencialmente relacionados aos lipídios nas membranas celulares. Uma vez no ambiente com as células, os detergentes começam a se integrar nas membranas, o que leva à sua destruição. E nós apenas precisamos disso. Às vezes, também é adicionada lisozima - uma enzima que destrói a parede celular bacteriana.
  
• Imprensa francesa. A suspensão da célula é sugada através da válvula de entrada para o cilindro de trabalho, de onde é espremida por uma prensa através de uma fenda estreita. As forças transversais decorrentes de uma queda de pressão na pressão atmosférica quando as células passam pelo espaço levam à destruição da parede e membrana celular.

Pela minha própria experiência, posso dizer que a sonicação em combinação com detergentes geralmente é mais do que suficiente.

Então, obtivemos um lisado celular - “sopa”, consistindo na proteína de que precisamos e uma enorme quantidade de “lixo” (DNA cromossômico e plasmídeo, pedaços da parede celular, várias proteínas, etc.). Como se livrar de tudo isso?

A primeira pergunta a ser respondida é: "De que forma nossa proteína existia na célula?" Existem duas opções principais:

• A proteína era solúvel antes da lise e, com uma probabilidade muito alta, permaneceu assim após ela, o que significa que não podemos sedimentá-la por centrifugação. Mas podemos precipitar o grande “lixo” deixado após a lise: dessa forma, nos livraremos de pedaços da parede celular, do DNA cromossômico e de outros grandes fragmentos. O precipitado é descartado e o sobrenadante é enviado para cromatografia;
  
• A proteína nas condições do citoplasma bacteriano era insolúvel e formava o chamado "Corpos de inclusão" preservados após a lise. Os corpos de inclusão são esferas de proteína que são formadas se a proteína durante a síntese não tiver tempo para dobrar (isto é, assumir a sua forma solúvel normal) antes de colidir com outra proteína não dobrada semelhante. As proteínas não dobradas quase sempre têm manchas hidrofóbicas destacadas, com a ajuda da qual elas se aderem. Depois que os dois esquilos “se juntaram”, eles não têm mais graus de liberdade suficientes para concluir a dobragem. Então um terceiro, quarto, quinto nadam até eles ... Como resultado, um grânulo de proteína é formado. Geralmente isso acontece quando sintetizamos proteínas eucarióticas em bactérias (como escrevi anteriormente, a bactéria não pode dobrá-las). Como resultado, temos uma massa de proteína com uma estrutura espacial "ruim". Mas toda nuvem tem um revestimento de prata, porque no final os grânulos são formados, consistindo quase inteiramente da proteína de que precisamos!
  
  Como neste caso nossa proteína é insolúvel, então, quando centrifugada, ela, juntamente com o "lixo", fica no sedimento. Nós descartamos o sobrenadante e, em seguida, os corpos no sedimento são lavados de tudo o que é desnecessário da seguinte maneira:
  
  1. O tampão de lavagem nº 1 foi derramado, no qual o “componente de lixo do sedimento nº 1” foi dissolvido;
  2. Agite o precipitado até ficar homogêneo e coloque-o em um agitador (um dispositivo que treme);
  3. O sobrenadante foi centrifugado e vertido. Como resultado, o que foi dissolvido no tampão de lavagem n ° 1 foi separado do precipitado;
  4. O tampão de lavagem nº 2 foi derramado, no qual o “componente de lixo do sedimento nº 2” foi dissolvido;
  5. Bem e assim por diante. Geralmente, são necessárias cerca de 5 lavagens.
  
  Deixe-me lembrá-lo mais uma vez de que, se estamos lidando com corpos de inclusão, estamos lidando com uma proteína desdobrada , o que significa que ela não é capaz de cumprir as funções nele estabelecidas. Portanto, antes da limpeza subseqüente, ela é redobrada, ou seja, é trazida para a forma ativa. O método de redobragem mais comum consiste nas seguintes etapas:
  
  1. Dissolver os corpos em condições "não fisiológicas". Normalmente, os corpos se dissolvem bem em pH alto (cerca de 12) na presença de uréia bipolar. A idéia desse método é que, com alto pH no meio, existem muito poucos prótons e todos que conseguem se livrar deles o fazem facilmente. O próton é carregado positivamente, o que significa que todos os doadores de prótons recebem uma carga negativa e, em seguida, a lei de Coulomb faz tudo - as proteínas com uma grande carga negativa começam a se repelir;
     
  2. Gota a gota, adicione todo o volume da “solução de proteína” do primeiro parágrafo a um volume muito maior do buffer ativamente misturado, com condições confortáveis ​​para a proteína. A idéia desse estágio é que, em uma baixa concentração de proteínas, é muito mais provável que ele desista antes de encontrar sua contraparte desdobrada. Tipicamente, a transferência de gotículas de uma solução de proteína é realizada em volumes de tampão que excedem o volume da própria solução em pelo menos 10 vezes.

Então, estamos prontos para alguns volumes de soluções de proteínas em um estado dobrado. O procedimento adicional é o mesmo para quaisquer "condições iniciais" - filtramos nossas soluções por filtros com tamanho de poro de 100-450 nm (para não entupir as colunas cromatográficas e o próprio cromatógrafo) e, em seguida, realizamos a cromatografia.

Tipos de cromatografia

O princípio de qualquer cromatografia é que os vários componentes da solução se movem pela coluna em velocidades diferentes, como resultado, os componentes que foram “na entrada da coluna” saem em momentos diferentes.

Mas primeiro, vamos relembrar outro método - eletroforese de proteínas em um gel.

Este método permite a separação de proteínas de acordo com suas massas. Para fazer isso, um tampão contendo SDS e um corante (geralmente azul de bromofenol) é adicionado à amostra. Ao mesmo tempo, a densidade do tampão é superior à densidade da água, isto é feito para que a mistura de amostra e tampão seja mais fácil de adicionar aos poços do gel. O corante é adicionado para controlar o procedimento de introdução da amostra no poço, e também serve como um indicador de que é hora de terminar a forese: a tinta se move mais rápido que a proteína, portanto, quando chega ao final do gel, a forese é interrompida. Isso é muito conveniente, pois não vemos o movimento da proteína ao longo do gel.


Eletroforese em SDS-PAGE. É melhor ler e ver uma vez do que ler cem vezes. Um marcador de peso molecular é aplicado ao primeiro poço em foresic no vídeo, e as amostras estudadas são aplicadas aos demais poços.

A SDS é um componente-chave: esse detergente com carga negativa (surfactante) desnatura as proteínas, após as quais as "envolve", e acontece que o número de moléculas de SDS aderidas à proteína é diretamente proporcional à sua massa. Segue-se da lei de Coulomb que, na ausência de resistência ao movimento, todas as proteínas envolvidas por moléculas de SDS teriam as mesmas acelerações no campo elétrico (a força cresce linearmente com o aumento da carga, mas a massa também cresce linearmente com a carga).


Esquema de ação do detergente com carga negativa SDS na proteína. Primeiro, ele a denuncia e depois a "envolve". Como resultado, a proteína consiste em um invólucro de carga negativa que consiste em SDS, cuja carga é diretamente proporcional à massa da proteína.

E aqui o PAAG (PAAG - gel de poliacrilamida) vem em nosso auxílio. Durante a polimerização, forma uma rede de canais de aproximadamente o mesmo diâmetro, através da qual, ceteris paribus, objetos pequenos se movem mais rapidamente que objetos grandes. Obviamente, a proteína pesada é maior que a luz, então as proteínas leves se movem mais rapidamente.

Após a conclusão do procedimento de eletroforese, o gel é corado. Mais precisamente, os locais em que a proteína está localizada no gel são manchados - são obtidas listras azuis (ou pretas, dependendo do que pintar). Para entender a que massa uma ou outra banda corresponde, é necessário compará-la com algo, para que o chamado gel seja aplicado a cada gel. "Marcador de peso molecular" é uma mistura de componentes com massas conhecidas.


Um exemplo de tiras marcadoras de peso molecular. Esse marcador também é conveniente, pois suas duas faixas são pintadas em uma cor individual: vermelho (70 kilodaltons) e verde (10 kilodaltons). Isso ajuda o pesquisador a navegar no próprio marcador. 1 dalton, é uma unidade atômica de massa, é definida como 1⁄12 da massa de um átomo de carbono livre em repouso-12, que está no estado fundamental.

Parece um milagre, não um método - as tiras não se sobrepõem, o que significa que as proteínas estão perfeitamente divididas! Mas, de fato, os cientistas não aprenderam a conduzir eletroforese de proteínas em escala industrial e, portanto, ainda usamos a cromatografia em coluna.


Um esquema aproximado de qualquer cromatografia. A coluna é um cilindro cheio de alguma coisa. Esse "algo" é chamado de "fase estacionária" e a "fase móvel" é a solução cujos componentes precisamos separar. Os componentes se movem em velocidades diferentes e, portanto, saem da coluna separadamente.

A maioria das técnicas cromatográficas é baseada no fato de que os esquilos que passam agarrados a um preenchedor de coluna estacionário "com entusiasmo diferente": aqueles que "se apegam" com frequência e se movem muito mais lentamente que todos, e aqueles que não "se apegam" a nada deixam a coluna rapidamente. Como resultado, uma parte substancial da mistura geralmente sai da coluna sem "prendê-la" - elas saem juntas no início da cromatografia (essa fração é chamada de "escorregamento", pois deslizaram pela coluna sem "prendê-la"). Mas o que fazer com aqueles que são "viciados"?

Primeiro, vamos descobrir o que acontece na coluna com quem "se apega". O "gancho" em si ocorre porque há algo na superfície da fase estacionária que é capaz de "capturar" uma proteína que passa (por um tempo) sobre como isso acontece. Ou seja, a proteína "aderente" passa algum tempo no estado associado à fase sólida e depois se afasta dela (devido ao seu próprio movimento térmico, colisões etc.), flutua, novamente se liga à fase sólida, novamente se separa e assim por diante até que ele saia da coluna. É claro que quanto mais frequentemente e mais forte ele se liga à fase estacionária, mais lento ele se move ao longo da coluna.


O princípio da cromatografia. O que não liga à coluna (deslizamento) se move com a velocidade da fase móvel (ajustada pelo tamanho). Os componentes de encadernação possuem velocidades diferentes, o que leva à sua separação na saída.

De um modo geral, somente no caso de muita má sorte na mistura haverá componentes diferentes que se movem na mesma velocidade, para que possamos esperar até que eles saiam da coluna. Mas muitas vezes fica "esperando" por muito tempo, pois os componentes se movem lentamente. Nesse caso, eles precisam ser "personalizados" e a maneira como são "personalizados" depende do tipo de coluna.

Finalmente, vamos examinar os métodos cromatográficos propriamente ditos, adequados para a produção industrial de brancos.

1. Cromatografia de troca iônica. A idéia do método é que a fase estacionária tenha uma carga nas condições de cromatografia. Se a carga é positiva, então eles falam sobre "cromatografia de troca aniônica", se negativo, então "troca catiônica".
   
   A lógica do nome é simples, vamos considerá-lo usando um trocador de ânions como exemplo: componentes com carga negativa da mistura “aderem” à fase sólida com carga positiva da coluna. Além disso, se seguirmos algum grupo específico carregado positivamente na superfície da fase sólida, um ou outro componente carregado negativamente irá "grudar" nele e sair. Assim, ocorre um tipo de troca aniônica entre as fases estacionária e móvel, daí o nome - "cromatografia de troca aniônica".
   
   Obviamente, se queremos usar a cromatografia de troca aniônica, devemos realizar a separação da mistura sob tais condições sob as quais a fase sólida é carregada positivamente. Ao mesmo tempo, temos duas opções para o desenvolvimento futuro de eventos, dependendo da carga que a proteína possui nessas condições: se "-", ela "se sentará" na coluna e, se "+", ela estará deslizando.
   
   Como acelerar a produção de componentes relacionados, isto é, como realizar a "eluição"? Você pode agir de duas maneiras:
   
   • Você pode alterar a carga da fase estacionária e os componentes ligados, alterando o pH da fase móvel. É importante realizar o processo de alterar o pH gradualmente, para que os componentes acelerem seu movimento, mas eles não "cairão" ao mesmo tempo, todos de uma vez;
     
   • Adicione outros ânions à coluna. De fato, a coluna tem um número finito de lugares para os quais os ânions podem se agarrar e, se ocuparmos todos esses lugares com alguma coisa, os componentes da mistura se moverão mais rapidamente. Para cromatografia de troca aniônica, a adição de ânions cloro é típica. A introdução de ânions concorrentes também deve ser realizada gradualmente.
   
   O procedimento para cromatografia de troca catiônica é geralmente o mesmo, apenas o oposto.
   
   
   
   
   Cromatografia de troca catiônica com eluição devido a uma mudança no pH da fase móvel.
   1 - em pH = 2, há muitos prótons na fase móvel, portanto, todos os componentes da mistura foram retirados do líquido, ao receberem uma carga positiva;
   2 - a pH = 5, o número de prótons na fase móvel diminuiu e o componente "púrpura" não atua mais como aceitador, mas como doador de prótons; portanto, nesse valor de pH, a carga é negativa e sai da coluna. O componente "verde" ainda atua como um aceitador de prótons e retém uma carga positiva em um determinado valor de pH, o que significa que ainda está segurando a coluna;
   3 - em pH = 9, há muito poucos prótons na fase móvel, o componente “verde” também se torna um doador de prótons, adquire uma carga negativa e deixa a coluna por último.
   
   Em geral, a escolha do tipo de trocador de íons e as condições para a separação dependem do que queremos isolar e do que mais há em nossa mistura.
   
2. Outro método de separação é baseado na hidrofobicidade (~ não polaridade) e hidrofilicidade (~ polaridade) de certas substâncias. A idéia aqui é exatamente a mesma que no caso do trocador de íons: de acordo com suas propriedades físicas, os componentes "correm" entre os meios hidrofóbico e hidrofílico, alguns permanecem mais, outros menos.
   
   Antes de tudo, lembro que o não polar se dissolve em não polar e o polar em polar. Freqüentemente “hidrofóbico” e “não polar” são o mesmo que “hidrofílico” e “polar”, embora no caso geral isso não ocorra. O etanol é um exemplo de solvente não polar e a água é um exemplo de polar.
   
   
   
   
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Bem então. Assim, isolamos nossa proteína e agora ela pode ser usada para estudos estruturais ou funcionais, como reagente em laboratório científico ou para análises ambientais, para fins médicos ou na indústria.