Em geral, escalamos as Filipinas e procuramos bactérias astutas. Então fomos à Islândia com químicos, e eles conversaram sobre as expedições de biólogos às montanhas para bactérias termofílicas (que vivem perto de fontes termais) - e descobriu-se que toda essa história era necessária para a reação em cadeia da polimerase. Tornou-se extremamente interessante para mim que relação o laboratório tem com os exames de sangue com a fonte geotérmica, e agora vou lhe contar essa história emocionante.
Isso significa que ontem em Vladivostok, Rospotrebnadzor e a Universidade Federal do Extremo Oriente abriram um centro de treinamento em PCR. Eu dirigi até lá junto com repórteres e encontrei cientistas loucos normais que explicavam tudo nos dedos. Porque é exatamente isso que eles farão lá - para ensinar vietnamita e chinês. Basicamente - aprenda a lidar com ameaças biológicas.
Então, o que é PCR?
Esta é uma história sobre como fazer vários milhões exatamente iguais a partir de uma única molécula de DNA.
Basicamente, esta é uma reação em três etapas: desvendar o DNA em hélices separadas, pesquisar e marcar o início e o fim dos locais desejados e, em seguida, completar as moléculas marcadas com a ajuda da polimerase para concluir. Ou seja, é um simulador de replicação de DNA em nosso corpo, feito apenas in vitro. E extremamente rápido.
Ou seja, cortamos todo o DNA em metades, encontramos apenas as metades do patógeno, as marcamos e a polimerase se acumula nos pares marcados. Nós repetimos. Nós repetimos.
A reação moderna dobra a quantidade de DNA no frasco a cada 40 segundos. Mais precisamente, a eficiência do ciclo é um pouco menor - de 78% a 99%, porque nem tudo e nem sempre está vinculado no mundo real.
Por que isso é necessário?
Se algum patógeno flutua no seu sangue, você pode criar uma reação específica para ele, que amplificará (aumentará a quantidade) de seu DNA. Em algum momento, haverá tantos na bebida que você poderá notar. E aqui o robô gritará: "Sim, entendi!", E o resultado será "positivo".
Como iniciante, precisamos apenas de 50 moléculas por mililitro no caso geral. Para comparação, o vírus da gripe não está no sangue, mas na saliva do paciente com os primeiros sintomas - cerca de 10 mil peças por mililitro.
Por que isso ainda é necessário?
Você pode literalmente comprar um par de DNA da múmia da pele de faraó, mamute ou tigre e sequenciá-lo com o genoma. Ou seja, é realmente possível considerá-lo completamente, porque a partir de uma quantidade desprezível de material para pesquisa você obterá muitas moléculas de DNA. Daí a aplicação na ciência forense - você pode estabelecer qual dos reis falecidos a quem era filho. Ou por um par de moléculas de saliva na cena do crime para encontrar o agressor (diretamente Gattaka). Ou ainda mais legal - você pode replicar moléculas com alterações e obter mutagênese controlada. Mas o último é difícil.
E a PCR é a mesma reação que muda o comportamento social da sociedade. Porque com a ajuda dela a paternidade é determinada - você pode selecionar apenas seções diferentes do DNA e avaliar onde e o que é diferente (e quanto), ou seja, procurar parentes próximos. Bem, ou apenas sequencie e avalie as diferenças.
Mas então estamos falando sobre o diagnóstico de infecções virais e bacterianas - esse é o uso mais difundido. E aqui eles o ensinam em Vladivostok.
Como é a PCR em geral?
Pegamos material, como sangue ou outra coisa. Preparamos cuidadosamente o medicamento (geralmente 1/3 do material é retirado, para que, em caso de erros na análise, mais duas doses permaneçam no arquivo até o final do estudo). A droga é misturada com um sistema de teste. Em um frasco fechado, colocamos essa "sopa" no dispositivo para realizar a reação.
Em seguida, iniciam-se os ciclos de desenrolamento do DNA, a ligação dos primers e o alinhamento das moléculas completas usando a polimerase. Os métodos modernos de PCR em tempo real sugerem que os rótulos desejados se acumulem e brilhem. Isso é incrível porque você não precisa abrir o tubo para reagir ao isolamento das sequências de DNA desejadas. Quando o brilho pode ser registrado, é decidido que as tensões desejadas nos materiais foram.
Mais alguns ciclos permitem avaliar o grau de alteração do sinal e hipotetizar quantas moléculas de DNA estavam inicialmente no material, ou seja, com precisão suficiente para determinar a concentração do patógeno.
Como o primer sabe o que se apegar?
Um primer é uma merda que se atém ao que corresponde ao seu código nucleotídico. Se você precisa do vírus da raiva, é necessário sequenciá-lo com um genoma (mais precisamente, estamos interessados no início e no final do DNA) e registrar os locais em ambos os lados da molécula onde as cadeias nucleotídicas são únicas. E faça cartilhas para eles. Os primers se ligam às metades do DNA, e a polimerase começará a funcionar de cima.
Então, nada se apega ao DNA das células sanguíneas, apenas à raiva.
Iniciadores da raiva só se apegam à raiva. Para diagnosticar sua vaca com raiva e gripe, você precisará de duas doses de sangue e duas reações diferentes.
Agora a parte divertida. Não precisamos do começo e do fim exatos da molécula de DNA para o diagnóstico. Só precisamos de muitos sites reconhecíveis. Ou seja, no genoma completo, por exemplo, gripe aviária, dois fragmentos únicos devem ser distinguidos - o início da cópia e o fim da cópia. Para que, entre eles, haja algo que possa ser inequivocamente identificado como gripe aviária sem gatilhos falso-positivos e falso-negativos.
Além disso, a matemática entra em jogo - é necessário distinguir lugares únicos do genoma, para que sejam muito curtos, idealmente de 15 a 30 nucleotídeos. E para que entre eles seja a coisa certa. Dois iniciadores fornecem algo como um hash de uma molécula de DNA, ou seja, permitem que ela seja descrita em 30 a 60 nucleotídeos.
Nestes locais mínimos suficientes para reconhecimento e iniciadores estão anexados. Se eles se apegam a outra coisa - o alvo é ruim e a precisão cai.
Então, o que as fontes termais têm a ver com isso?
O fato é que a reação ocorre em alta temperatura, caso contrário, o DNA não desnatura. A polimerase nessa temperatura geralmente se decompõe. Geralmente - porque é especificamente com bactérias termofílicas que ela se preocupa com calma. Portanto, houve expedições a Kamchatka no século passado, onde os geólogos procuravam meios para a medicina molecular, disparando ursos. E na Europa eles dirigiram para a Islândia.
O engraçado é que, em 1976 e em 1980, havia publicações sobre a polimerase (nossa e americana), mas pareceu a todos um fato engraçado, e elas não encontraram aplicação prática.
Agora em diante. Acontece que a polimerase Taq da Thremus aquaticus funciona de acordo com um protocolo como o UDP, ou seja, sem correção de erros. Geralmente. Reúne o que acontece - e se dá bem sozinho. Mas rapidamente.
As polimerases de Pfu e Pwo foram isoladas da arquéia - elas trabalham com correção de erros, ou seja, não produzem mutações durante o processo de replicação (bem, quase não produzem), mas agem muito mais lentamente.
Anteriormente, os estoques dessa sede eram recolhidos diretamente de fontes, agora a polimerase é criada em laboratórios. E eles fazem uma mistura complicada de Pfu, Pwo e Taq - acontece rápido e relativamente correto.
Como é no mundo real
No mundo real, você tem uma caixa de sistemas de teste com a intrigante inscrição "sífilis", por exemplo. Ou gripe. Dentro de um sistema de teste - todos os componentes para PCR, exceto a matriz de DNA, ou seja, o sangue do paciente. Ou outro pedaço dele onde o patógeno é procurado.
Em seguida, você precisa misturar o sangue e o sistema de teste, aquecer e esfriar muitas vezes sob pressão, e o catalisador, os primers, a polimerase e os componentes auxiliares farão tudo sozinhos. O resultado é um tubo de ensaio com 10 na décima segunda molécula de DNA por mililitro.
Isso pode ser feito na cozinha?
Em teoria. O dispositivo em si é muito simples, toda a alta tecnologia no sistema de teste - e um pequeno software que registra a alteração no sinal luminoso da etiqueta. Ainda precisa de precisão na temperatura de 0,1 graus e programas para sua alteração. Além de um fotossensor. Ou seja, o ferro não é muito complexo. Portanto, existem muitos desses laboratórios - eles são realmente baratos de implantar.
Mas na cozinha não dá certo, porque a pior história é a contaminação da amostra (poluição). Protocolos de pureza são ensinados mais do que as próprias reações. Se um dos tubos resultantes com DNA de patógeno quebrar no laboratório, tudo será coberto com uma camada uniforme de resultados falso-positivos. Ou seja, todas as análises atuais - imediatamente pela floresta, depois uma longa limpeza, verificação e recuperação do sangue arquivado e novamente o lançamento da linha.
Bem, isso, eu lembro, que o DNA do patógeno e o próprio patógeno são duas coisas diferentes, como o código fonte e o código compilado. E o perigo de você quebrar um tubo de ensaio com 10 no décimo segundo DNA do patógeno da tuberculose é quase o mesmo que espalhar um pacote de folhas do código-fonte para lançar uma ogiva nuclear no chão.
4-7% dos resultados podem ser falsos positivos devido ao trabalho superficial e aos recursos do mundo real. Portanto, é realizada uma verificação completa da confiabilidade do resultado, em particular, usando métodos matemáticos.
Juntamente com os materiais de PCR convencionais, é submetido um tubo de ensaio com água. Se algo começar a se amplificar lá, o técnico será arrancado das mãos das amígdalas.
Isso não é seguro, é uma porta de entrada para a transferência de material para o laboratório. O pessoal é transferido para o laboratório em uma área limpa após um banho, troca de roupa e alguns procedimentos mais degradantes da dignidade humana.Como você pode entender que algo está errado com a reação?
Pela natureza do seu desenvolvimento. A reação usual começa lentamente, depois a fase de crescimento exponencial, depois na área dos últimos ciclos - sai para o platô. A quantidade de DNA não aumenta com novos ciclos por dezenas de razões, desde a depleção do primer até a conclusão de um dos recursos acumulados pelos pirofosfatos. Além disso, metades de DNA que não reagiram antes de nadar na sopa e se escalam para um abraço. Como resultado, é possível identificar artefatos e um curso atípico da reação - isso já cria software para mineração de dados pequena. Doméstico, gratuito, atualizado regularmente, mas não de código aberto.
E por que você precisa aumentar a quantidade de DNA na droga, se tudo o que você precisa é melhorar os métodos de detecção?
Existe um caminho de desenvolvimento. Os métodos físico-químicos estão sendo aprimorados, mas até agora não são suficientes. A experiência mais recente - eles tomaram plasma sanguíneo, centrifugaram, vírus "pesados" caíram no fundo do tubo. Depois foram fritos com um espectrógrafo de massa a laser. Nifiga. Funciona com colônias de bactérias (elas já fazem isso nos laboratórios de Moscou há muito tempo), mas não funciona com vírus. E a colônia ainda precisa ser cultivada. Portanto, até o momento (e, ao que parece, nos próximos dez anos), a PCR será a coisa mais rápida para análise.
A propósito, uma análise completa é feita em cerca de 45 minutos (com a preparação do material), ou seja, meio dia de
cito ou 4 dias se o laboratório estiver na cidade e você estiver na vila.
Para algumas doenças infecciosas, a concentração do vírus é extremamente baixa. Por exemplo, houve um caso de encefalite - o clínico observou sintomas focais (danos ao sistema nervoso central), tirou sangue - até a PCR ainda não mostra nada e os anticorpos já estão implantados. Ou seja, a PCR daria um resultado mais tarde do que a análise de anticorpos e a espectrografia de massa - ainda mais tarde, ainda é uma ordem de magnitude menos precisa que a PCR.
Ou seja, apenas um genoma específico é amplificado?
No caso usual, sim. A cepa mais avançada da doença é relevante para a região e os primers têm como alvo seu DNA. Mas essa é uma situação um pouco utópica, porque, ao mesmo tempo, você precisa procurar seis peças de diferentes linhagens ao mesmo tempo. Para fazer isso, diferentes iniciadores são adicionados ao conjunto, além de várias alterações. Naturalmente, o sistema de teste é mais caro. Ou você precisa fazer várias reações para diferentes patógenos.
Posso multiplicar RNA?
Sim, você só precisa criar DNA com isso. A reação é mais complexa, mas interessante, pois permite separar as células mortas das células vivas. O DNA é incrivelmente forte, e pode ser retirado de um mamute. Se o vírus já tiver sido morto, o DNA de suas amostras mortas "brilhará" por mais 3 semanas. E o RNA vai desmoronar muito mais rápido. Portanto, os métodos NASBA (pesquisa de vírus RNA, por exemplo) são muito mais precisos em alguns casos. Mas muito mais caro.
Mais algumas coisas bonitas
Toda a história da implementação da PCR após a invenção da teoria é diretamente problemas físicos e químicos complicados. Por exemplo, seções desconhecidas do DNA podem ser amplificadas. Para fazer isso, a molécula é cortada em uma área conhecida e os pedaços são colados. Alguns se viram para formar moléculas com um código conhecido no começo e no fim. Os primers se apegam - e naqueles onde há um começo e um fim, e não apenas um marcador, a amplificação é realizada.
Uma história muito engraçada sobre como evitar reações desnecessárias ao aquecer o tubo. O fato é que a primeira parte da reação prossegue em alta temperatura, mas enquanto o tubo de teste esquenta, você pode acidentalmente começar com a batida errada - isso aumentará acentuadamente o ruído e a probabilidade de erro. Portanto, as opções com o fato de que um dos reagentes do sistema é colocado em uma cápsula de cera (derrete somente depois de passar pelo ponto desejado e libera o componente no prazo) chegaram à opção quando uma substância é adicionada à solução que bloqueia a reação, mas quebra em alta temperatura.
Há proteção contra a poluição - as moléculas em amplificação podem ser rotuladas de uma certa maneira e, no início da reação, destruir todas as rotuladas dessa maneira. Ou seja, se algo de um tubo se arrastar para outro, ele será preenchido automaticamente até as principais reações.
A fluorescência também é legal: uma substância é colocada nos reagentes, que é destruída como resultado de reações com o DNA. Ou seja, quanto mais DNA é formado, mais moléculas dessa substância são quebradas. O todo não brilha, mas em pedaços começa. E quanto mais moléculas de DNA reagem durante a replicação, mais o tubo brilha.
Dado que a complexidade dos sistemas de teste está crescendo, hackers e soluções elegantes são o mar.
Por que os centros de treinamento de PCR nas universidades?
Porque essa ainda é a história principal sobre o diagnóstico de doenças, e não necessariamente nas pessoas. Aqui, no Extremo Oriente, por exemplo, o foco pode estar nos fitovírus. Há um vírus binário nas caixas da pátria com especiarias de arroz (mais precisamente, dois vírus bem compatíveis) que podem levar e distribuir toda a colheita em toda a Ásia para distribuição. Naturalmente, tal coisa não é apenas nossa - e não será necessariamente lançada maliciosamente; pode se desenvolver de acordo com a idiotice ou simplesmente em uma lareira natural. Como a encefalite japonesa em Primorye, focos sazonais de mosquitos surgem constantemente aqui. E a mortalidade é de 60%.
O suposto adversário também tem vírus em animais e humanos.
Assim, especialistas em PCR representam a biossegurança do país. Eles monitoram infecções, pegam todos os passageiros do avião, onde algumas pessoas tossem e assim por diante. Michael, por exemplo, voou no ebola, contra a gripe aviária e muito mais. Ele sequenciou o genoma completo da única cópia viva do vírus da raiva no mundo.
Mikhail Shchelkanov, Professor, FEFU, Chefe do Centro Federal de Pesquisa em Virologia para Biodiversidade, Filial do Extremo Oriente da Academia Russa de CiênciasCom um urso em geral, uma história incrível. O urso levantou cinco cães e depois atacou a avó. Ele girou o pulmão dela e tirou o couro cabeludo, além de babar por toda parte e coberto de sangue. Os caçadores decidiram sobre a besta que era algum tipo de urso errado. E eles deram seus restos mortais aos cientistas para experimentos.
Aqui estão mais detalhes.
Mikhail também é um fã de focas, porque ele adora ilhas com viveiros. Eles transmitem vírus e parasitas extremamente rapidamente para toda a população. Eles encontraram em gatos nas narinas um piolho fresco, com bactérias não menos frias. Quando um selo mergulha, ele fecha suas narinas. O piolho dentro é quente e encantador.
Além da biossegurança, a segunda história é a formação de especialistas estrangeiros. Há duas coisas importantes: em primeiro lugar, eles estudam em nossos sistemas de teste (e, em seguida, terão mais probabilidade de comprá-los), e isso é importante para exportação - somos líderes na CEI (aproximadamente 25 milhões de reações por ano), mas não no mundo . Em segundo lugar, a uniformidade da experiência permite o mesmo monitoramento por protocolos comuns, ou seja, altera os bancos de dados e a experiência. Bases, é claro, são mais importantes. Isso significa uma resposta muito mais consistente a possíveis epidemias.
Em Vladivostok, a abertura oficial não coincidiu com a técnica - um grupo de médicos vietnamitas está terminando suas últimas lições. Dois sabem russo, o resto aprende através deles. Existe um curso totalmente de inglês. O mesmo centro funciona em Novosibirsk para médicos e médicos russos dos países da CEI, e especialistas estão se formando lá há um ano.Também estamos fazendo tudo pelos nossos sistemas de teste na Rússia e, na prática, a biologia molecular é uma das mais poderosas do mundo (em teoria, não, mas implementamos tudo de forma rápida e técnica). Portanto, a educação ajudará a expandir esse mercado para nós. No total, 3881 especialistas foram treinados em tais centros (pequenos grupos, porque há muita prática), e agora a tarefa é ampliar o treinamento de especialistas estrangeiros.
Isso é chamado de Centro Internacional de Treinamento de Rospotrebnadzor na Escola de Biomedicina da Universidade Federal do Extremo Oriente. Foi aberta, de fato, por Mikhail Shchelkanov com a foto acima e pela alemã Shipulin (FBUN CRI de Rospotrebnadzor em Moscou). As provas na mídia serão amanhã, aparentemente. Bem, eu não sou um microbiologista, então se eu cometi um erro em algum lugar acima, por favor, por favor.
UPD: aqui estão as notícias sobre a
RG , que ainda têm um ponto de vista sobre essa história.