Análise da velocidade micromotora molecular para diagnóstico de HIV

O vírus da imunodeficiência humana ou simplesmente o HIV é a praga do século XX. Um título bastante alto, mas não é exagerado. Esta doença reivindicou milhões de vidas. E a cada ano cresce o número de vítimas dessa doença insidiosa, bem como o número de estudos voltados para o tratamento e diagnóstico do HIV. Qualquer doença e o HIV não são exceção, são mais fáceis de tratar nos estágios iniciais do desenvolvimento. Mas isso requer uma maneira de reconhecê-lo o mais cedo possível, mesmo antes dos primeiros sintomas começarem a se manifestar. Quando você diz um corte, vê um corte, ou seja, sabe claramente o que tratar. O HIV pode viver no corpo humano sem se manifestar, isto é, de forma assintomática, por algum tempo. Hoje vamos considerar uma nova invenção que pode determinar com rapidez e precisão a presença do vírus da imunodeficiência através de um pequeno dispositivo conectado a um smartphone. Como essa inovação funciona, qual a precisão de seus resultados e o que os pesquisadores estão planejando no futuro? Procuraremos respostas para essas e outras perguntas no relatório do grupo de pesquisa.

Base teórica

Falar sobre doenças é desagradável, mas necessário. Quanto mais soubermos sobre eles, melhor poderemos proteger a nós mesmos e a nossos entes queridos de sua influência.



O vírus da imunodeficiência humana em HIV mostrou sua careta terrível no início dos anos 80 do século passado. Então ninguém sabia o que era, e o próprio vírus nem sequer tinha um nome. Pesquisas posteriores mostraram que o HIV é um retrovírus que infecta células do sistema imunológico do corpo, um dos sistemas mais importantes. O efeito do vírus é a supressão da defesa imunológica e o desenvolvimento da síndrome da imunodeficiência adquirida pela AIDS. Nesse estado, o corpo permanece indefeso, e qualquer infecção, mesmo a mais leve, (assim como as células cancerígenas) pode afetá-lo drasticamente. Em essência, o HIV destrói nossa defesa e os inimigos diante das infecções tomam calmamente o corpo.

O HIV possui um mecanismo de transmissão de contato. A infecção pode ocorrer através do contato com sangue, sêmen, leite materno, líquido pré-semeado ou secreções vaginais. Em outras palavras, relações sexuais desprotegidas, instrumentos médicos infectados e até agulhas não infectadas em estúdios de tatuagem são uma ótima maneira de espalhar o vírus. No período do surgimento do HIV, quando o pânico se espalhou entre a população mais rapidamente do que informações confiáveis ​​sobre o que é o HIV e como ele se espalha, acreditava-se que a infecção pudesse ser causada por um simples aperto de mão. Isso é um mito, porque o vírus não se espalha através de um simples toque com uma pessoa infectada. No entanto, essa opção de infecção também é possível, mas apenas no caso de feridas abertas nas mãos dos infectados e possíveis vítimas de infecção. Não estou falando do fato de que alguns considerados mosquitos transmissores do HIV (um mosquito bebe o sangue de um paciente e, tendo mordido uma pessoa saudável, pode infectá-lo) também é um mito.


Prevalência mundial de HIV de acordo com a Organização Mundial de Saúde (2017).

Não descreverei em detalhes o vírus e as conseqüências de seu desenvolvimento no organismo, porque discutiremos não tanto o próprio vírus como um novo método para seu diagnóstico. Mas é importante notar que o HIV é um vírus de paciente que pode sofrer mutações no corpo de uma pessoa infectada ao longo do tempo, o que o torna ainda mais resistente a vários métodos de contenção ou tratamento. Essa é outra razão pela qual deve ser detectada o mais cedo possível. Quanto mais tempo o vírus tem, mais forte é e mais fraca é a pessoa infectada.

Em que consiste o dispositivo?

Os cientistas envolvidos neste estudo dizem que um dos problemas e barreiras mais graves no diagnóstico precoce do HIV, como outras doenças, no mundo é a falta de condições adequadas: laboratórios, pessoal, instalações médicas. Por isso, eles decidiram criar um dispositivo que pode indicar com precisão se existe ou não um vírus no corpo. Os níveis de açúcar no sangue já podem ser verificados por um longo tempo usando dispositivos compactos portáteis (glicosímetros), ou seja, sem a necessidade de visitar o laboratório e aguardar os resultados do teste por vários dias. O custo de tais dispositivos é bastante baixo, o que também acompanha sua distribuição.

O dispositivo com o qual nos familiarizaremos hoje pode ser brevemente descrito da seguinte forma: um analisador móvel para a determinação molecular do HIV-1 com base na amplificação isotérmica de alça (LAMP) e nanomotores (CALM). E agora, em ordem.

Nanomotores

Nanomotores (também chamados de micromotores) são chamados de dispositivos moleculares microscópicos capazes de converter energia em movimento. Se eles são colocados em uma solução química específica, eles começam a se mover de maneira independente por uma rota específica, que pode ser usada em diagnósticos e até no fornecimento de energia de dispositivos nanotecnológicos.


O esquema de formação micromotora para um testador de HIV.

Micromotores são esferas feitas de poliestireno revestido com nanopartículas de Pt (platina) com uma densidade de 1,04 g / cm. Além disso, nanopartículas de Au (ouro) também foram usadas para modificar micromotores com sondas de DNA (no diagrama acima, eles são apresentados como "tentáculos" vermelhos).

Um TEM (microscópio eletrônico de transmissão) mostrou que as nanopartículas de platina e ouro utilizadas no revestimento de micromotores tinham forma esférica e diâmetro de 57,721 ± 5,181 nm (Pt) e 3,43 ± 1,336 nm (Au).


Acima, imagens TEM, frascos fotográficos com nanopartículas e os resultados da espectroscopia óptica.

Era necessário verificar com que eficiência uma sonda de DNA de um micromotor totalmente formado pode capturar moléculas de DNA. Para isso, foi utilizada a técnica de eletroforese em gel de agarose * (C12H18O9).

A agarose * é um polissacarídeo linear formado por uma sequência de resíduos de β-D-galactopiranose e 3,6-anidrido-α-L-galactopiranose ligados por uma ligação 1 → 4. Obtido em ágar.

Essa técnica nos permitiu confirmar que os micromotores têm sondas de DNA em sua superfície, pois foram capazes de anexar uma molécula de DNA artificial de cerca de 180 pb (bases emparelhadas), o que é um excelente resultado para uma amostra (artificial) (imagem à esquerda). O grau de eficiência de captura durante os primeiros testes foi de aproximadamente 30%, o que é confirmado por fluorimetria (imagem à esquerda).


Aqui vemos como os micromotores se movem em solução com diferentes concentrações de H ₂ O ₂ (0, 5, 10 e 15%).

Também foi necessário verificar a característica mais importante dos micromotores - movimento. Para isso, _{foi utilizada} uma solução com e sem H ₂ O ₂ (comparação das trajetórias na imagem d abaixo). Quando o peróxido de hidrogênio estava ausente, os micromotores vibravam, devido ao movimento browniano. Quando o H2O2 começou a ser introduzido na solução, a velocidade dos micromotores aumentou cerca de 0,7 μm / s para cada 1% de peróxido de hidrogênio na solução.


Medição da velocidade dos micromotores em uma solução de teste.

A Figura a mostra a dependência da velocidade dos micromotores com um diâmetro de 6 μm e a concentração de H2O2 em solução. Também (à direita) está um instantâneo do micromotor e sua trajetória. O diagrama b mostra o grau de estabilidade dos micromotores a várias temperaturas em uma solução de peróxido de hidrogênio a 5%. Abaixo (gráfico e instantâneo), vemos como o indicador de estabilidade muda ao longo do tempo (120 s), bem como a trajetória de movimento já em uma solução de 15%. O deslocamento médio quadrático da raiz ao longo do tempo é mostrado nos gráficos e : pontos pretos - uma solução sem H2O2, vermelha - 5% de H2O2.

Abaixo, na imagem f , vemos que não apenas o estado da solução onde os micromotores estão localizados afeta seu comportamento, mas os próprios micromotores e, mais precisamente, sua estrutura, também a alteram significativamente. Vemos como os micromotores com um diâmetro de 3 μm sem deposição de platina e ouro se movem (linhas azuis) em comparação com os micromotores completos testados com um diâmetro de 6 μm (linhas vermelhas). À direita da comparação das trajetórias está uma comparação do deslocamento quadrado médio dos micromotores (3 μm e 6 μm de diâmetro).

Dispositivo móvel

O Motorola XT1575 (Android OS) foi usado para visualizar e rastrear micromotores (ou seja, para monitorar como os diagnósticos ocorrem).


Aparência e detalhes do dispositivo.

Um componente importante do dispositivo é o chip necessário para verificar o movimento dos micromotores. Foi feito de polimetilmetacrilato (plexiglas). Uma base de vidro com um “canal” cortado a laser de 2 mm de largura foi anexada a ela usando uma camada de cola de 80 μm.


A aparência do chip e suas dimensões.

Como pode ser visto nas figuras acima, o chip não é a única parte do dispositivo. O estojo removível azul era feito de materiais baratos em uma impressora 3D. Dentro deste gabinete, há um LED branco, uma bateria de 3,3 V, um comutador e lentes ópticas de baixo custo. Também no caso, há um suporte de amostra que permite colocá-los entre as lentes e a câmera do telefone.

E agora sobre o componente de software. O software foi criado no Android Studio usando as bibliotecas OpenCV 3.1.0. A interface, segundo os cientistas, foi feita da maneira mais clara e prática possível para os usuários.


Interface de testador de HIV.

Quando a amostra é colocada no dispositivo, o programa grava um vídeo (30 qps, 320x240 pixels), que mostra o movimento dos micromotores, calcula sua velocidade e em 1 minuto fornece o resultado da análise.

Amplificação Isotérmica de Loop (LAMP)

Qual a eficácia do sistema micromotor no reconhecimento do HIV-1? A resposta a esta pergunta está nas reações da LAMP. Para o teste, várias amostras foram preparadas com diferentes concentrações de RNA do HIV-1 (ácido ribonucleico). O resultado da amplificação foi avaliado por eletroforese em gel de agarose.


Teste LAMP.

Os resultados da eletroforese mostraram a formação gradual de grandes amplicões de DNA (sequência de DNA, resultado de amplificação). O número de amplicons foi proporcional à concentração de RNA do HIV-1.

Os micromotores foram misturados com os amplicons de RNA do HIV-1, possibilitando um processo de hibridação (a uma temperatura de 80 ° C). A seguir, a "mistura" resultante foi testada em uma solução a 5% de H2O2. Quando os amplicons de RNA do HIV-1 estavam presentes no sistema, a velocidade dos micromotores foi bastante reduzida, em cerca de 95,26%. Uma diminuição na taxa é observada mesmo em uma baixa concentração de amplicons (cerca de 3,394 ± 0,245 ng / µl).


Demonstração de movimento micromotor na ausência de RNA do HIV-1.


Demonstração de movimento micromotor na presença de RNA do HIV-1.

Os cientistas também conseguiram restaurar micromotores e sua velocidade. Para isso, a amostra "infectada" com micromotores e amplicons foi incubada por 30 segundos a uma temperatura de 90 ° C. Isso tornou possível liberar amplicons das sondas de DNA micromotoras. Isto foi seguido por centrifugação a 6000 x g durante 5 minutos. A verificação da amostra obtida em uma solução a 5% de H2O2 mostrou que a velocidade do micromotor foi restaurada ao nível de 75,52% do original, antes do teste com a participação dos amplicons de RNA do HIV-1.

Também foi testada a reação do sistema a outros tipos de vírus sexualmente transmissíveis: hepatite C e B, herpes, vírus do papiloma 16 (HPV-16). Devido aos casos freqüentes de infecção paralela ao HIV e a alguns dos vírus acima, esse teste também foi de grande importância. O resultado foi satisfatório - os amplicons de DNA foram formados apenas na presença do HIV. Ou seja, a presença de outros vírus na amostra de teste não afetou o processo de verificação.

A conclusão é simples - o método é capaz de determinar a presença do HIV. Mas agora é necessário realizar uma calibração para que o sistema possa distinguir a presença e ausência do vírus na amostra, concentrando-se na concentração padrão de 1000 partículas / ml. Se a concentração estiver abaixo deste indicador, o resultado será negativo (não há vírus); se a concentração for maior, será positiva. Para realizar a calibração, foi necessário determinar qual velocidade dos micromotores corresponde a qual concentração. Para isso, foram utilizados PBS - tampão fosfato de sódio (uma solução especial para pesquisa) e o plasma de pacientes com e sem HIV.

A calibração foi realizada usando PBS, em que a concentração de RNA sintético estabilizado do HIV-1 variou de 0 a 107.

Após a calibração, ficou claro que a velocidade micromotora média na concentração de HIV de 1000 é de 0,705 ± 0,082 μm / s.


Os resultados da determinação da concentração de RNA do HIV-1.

Os cientistas também analisaram o sistema usando a curva ROC, que mostrou resultados muito animadores. A sensibilidade * do sistema testado foi de cerca de 94,6% com um IC * de 81,8 a 99,3% e a especificidade * de 99,1% com um IC de 80,5 a 100%.

Sensibilidade * - um indicador que reflete a parcela de resultados positivos (neste caso, é a probabilidade de a concentração de HIV na amostra estar acima de 1000).

Especificidade * é um indicador que reflete a parcela de resultados negativos (neste caso, é a probabilidade de a concentração de HIV na amostra estar abaixo de 1000).

DI * - intervalo de confiança, ou seja, o intervalo que cobre um parâmetro desconhecido com uma dada confiabilidade.

O gráfico de dispersão dos resultados do sistema também mostrou resultados incríveis. Assim, a precisão de determinar uma amostra com uma alta concentração de HIV como positiva é de 100% e a precisão de determinar amostras negativas é de 90%.



Aqueles que desejam se familiarizar com o estudo em mais detalhes podem consultar o relatório dos cientistas e materiais adicionais .

Epílogo

Os cientistas que criaram este incrível dispositivo não negam que ainda precisam realizar muitos testes, calibrações e melhorias. Mas eles estão claramente no caminho certo. Tais dispositivos podem reduzir significativamente a propagação do HIV, especialmente entre pessoas em locais onde laboratórios com equipe e um monte de equipamentos médicos simplesmente não estão disponíveis.

Sim, o dispositivo ainda não parece muito compacto e o fato de exigir o uso de um smartphone pode afastar alguém. No entanto, no futuro, essas tecnologias para o diagnóstico precoce do HIV continuarão a melhorar, não apenas em termos de eficiência e precisão, mas também em termos de conveniência e acessibilidade.

O HIV é a praga do século XX, como escrevi no começo desta história. Infelizmente, porém, esse vírus não está tão longe do título de "praga do século XXI". Atualmente, várias doenças já reivindicam um título tão alto (por exemplo, depressão, diabetes, etc.). E cada uma dessas doenças requer muita atenção. Embora não exista uma pílula mágica que possa curar qualquer doença, só podemos melhorar os métodos de diagnóstico disponíveis, o que nos dá tempo adicional para procurar tratamento ou conter a doença. Como se costuma dizer, quanto mais cedo soubermos de um problema, maiores serão as chances de resolvê-lo.

Outro ponto importante é a atividade social, abertura e discussão. O problema deve ser discutido, porque, mesmo que seja assustador falar sobre isso, como a sociedade pretende combatê-lo?

De qualquer forma, isso é tudo para mim. Cuide de si e de seus entes queridos.

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