Moscas invisíveis: um novo método para estudar o sistema nervoso através da despigmentação dos tecidos

O estudo de um organismo é um processo complexo e requer precisão. Os métodos modernos de digitalização conseguiram isso. Hoje podemos estudar com detalhes suficientes o corpo ou um órgão individual em imagens tridimensionais. Cerca de 100 anos atrás, uma visão tridimensional dos órgãos só poderia ser obtida removendo-os do corpo e examinando-os ao vivo, por assim dizer. No entanto, sempre há algum "mas". Mas mesmo os scanners e microscópios mais precisos não podem fornecer 100% de precisão. Agora, se fosse possível tornar tudo desnecessário invisível, e deixar visível a parte do corpo que queremos estudar. Parece ficção científica, não é? Eu concordo Mas agora é real. Hoje conheceremos o estudo de um novo método para a varredura de organismos usando o exemplo da Drosophila. Como os cientistas conseguiram tornar um midge de frutas comum "invisível", qual a precisão do seu método de varredura e como isso ajudará no diagnóstico de doenças humanas? As respostas para essas e outras perguntas só podemos obter no relatório dos pesquisadores. Então não vamos puxar. Vamos lá

Base de estudo

Como eu disse em um dos artigos anteriores , cujo personagem principal, como hoje, era Drosophila, esse inseto pequeno e, na verdade, irritante, é objeto de muitos estudos. Com sua ajuda, os cientistas estão estudando muitas coisas: da aerodinâmica ao sistema nervoso. E é sobre este último que será discutido hoje. O estudo de sistemas tão complexos em organismos tão pequenos está repleto de certas dificuldades. Já estamos familiarizados com os métodos de estudo de organismos, cortando-os em várias camadas ultrafinas. Este método permite estudar muitos sistemas em mais detalhes. No entanto, em relação ao sistema nervoso, este método, segundo os pesquisadores, viola a integridade celular, o que complica o processo de estudo de partes individuais do sistema.



Se aplicarmos a varredura em pequenos organismos sem "camadas" físicas, veremos todos os sistemas ao mesmo tempo. Mas os cientistas querem estudar apenas um sistema, enquanto outros não devem interferir nesse processo. Portanto, eles tiveram uma idéia brilhante e simples - tornar tudo invisível (ou melhor, transparente) e deixar o sistema desejado intocado.

No momento, existem ferramentas suficientes para implementar essa idéia, resta apenas combiná-las. Os principais ingredientes de um novo método de digitalização chamado FlyClear (em homenagem ao primeiro sujeito de teste - a Drosophila voa) são a "limpeza" dos tecidos e a ultramicroscopia.



A Drosophila foi escolhida como sujeito de teste por um motivo. A base da maioria dos métodos de limpeza de tecidos é a modificação genética do organismo em teste. Neste caso, é fluorescência. Esse processo é extremamente complexo e demorado. Quanto maior o corpo, mais tempo será gasto em sua modificação. Além disso, nem todas as criaturas podem ser modificadas da maneira que os cientistas desejam. Drosophila se presta a manipulações genéticas semelhantes com bastante facilidade, e esse processo não leva muito tempo.

No momento, o método mais popular de estudar organismos é a microscopia confocal, mas é realizada somente após a dissecção dos tecidos. A questão surge - e se não dissecamos? Nesse caso, obtemos uma imagem pálida de baixa qualidade e o processo em si levará muito tempo. Forte absorção e dispersão de fótons na amostra também serão observados, especialmente com o aumento da pigmentação do tecido (como em Drosophila). Consequentemente, a amostra deve ser limpa, ou seja, tornada transparente. Assim, para nivelar a diminuição da intensidade do sinal e obter uma resolução espacial uniforme. A principal maneira de tecido "opaco" (desculpe-me por uma palavra fictícia) é reduzir o índice de refração nos limites entre os componentes celulares.

Os pesquisadores não negam que agora existem várias maneiras que já se tornaram clássicas para tornar os tecidos transparentes. No entanto, eles também afirmam que esses métodos têm várias desvantagens. Preservação da morfologia, estabilidade da fluorescência, profundidade de varredura e assim por diante - com todos esses aspectos, os métodos existentes, para dizer o mínimo, não são bons. Além disso, nenhum deles fornece despigmentação completa dos tecidos.

Acontece que, para uma melhor varredura de pequenos corpos, ainda é necessário realizar uma seção transversal de tecidos? Na verdade não. Os cientistas citam a mesma Drosophila como exemplo. Localizados em suas regiões periféricas (pernas, olhos, antenas), os neurônios sensoriais de Drosophila têm conexões muito longas com numerosos nervos e com o cérebro. Se essas regiões estiverem em camadas, não teremos uma imagem completa de como o sistema nervoso está estruturado nessas regiões.

Neste estudo, o método FlyClear nos permitiu remover a pigmentação do tecido de Drosophila, expondo seu sistema nervoso. Demorou cerca de um mês. E a ultramicroscopia nos permitiu visualizar as menores conexões neurais e construir um mapa completo do sistema nervoso da montanha. Uma substância também teve um papel importante, com a ajuda da qual foi possível “colorir” o sistema nervoso em uma cor verde brilhante - uma proteína verde fluorescente (doravante denominada ZFB). O gene para esta proteína, obtido da água-viva Aequorea victoria, é usado precisamente para a modificação genética de amostras de teste.


Água-viva Aequorea victoria.

Os dados obtidos por microscopia de fluorescência foram processados ​​por um algoritmo especial que permite criar uma imagem tridimensional com alta resolução.

Preparação do estudo

A limpeza óptica do tecido de Drosophila não é um processo fácil. O exoesqueleto quitinoso e os fotopigmentos dos olhos facetados são as regiões mais difíceis do corpo da mosca para o procedimento. Os métodos atualmente disponíveis de limpeza de tecidos estão longe de ser ideais, porque os pesquisadores criaram os seus - o FlyClear, que mencionei anteriormente.

FlyClear combina vários dos métodos anteriores. O primeiro deles no processo é o CUBIC (coquetéis de imagens cerebrais claros e desobstruídos). Outras etapas dependem do estado da amostra (larva ou adulto).


Opções para o procedimento FlyClear.

No caso da larva, são utilizadas 0,03% de protease e fixação de formaldeído. O fato é que a protease quebra as ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas, e isso ajuda a "descolorir" os tecidos. Em seguida, a acetona é usada na amostra para permeabilização (alterações na permeabilidade da membrana celular).

Os cientistas conseguiram melhorar o estágio CUBIC substituindo [CH ₃ CH (OH) CH ₂ ] ₂ NCH ₂ CH ₂ N [CH ₂ CH (OH) CH ₃ ] ₂ (N, N, N ', N'-tetraquis (2-hidroxipropil ) etilenodiamina) em C10H24N2O4 (2,2 ', 2 ", 2"' - (etileno dinitrila) tetraetanol)). Essa alteração possibilitou a despigmentação completa dos tecidos, inclusive em áreas complexas (olhos e epiderme).

Assim, o método de despigmentação completa do tecido funciona. Agora você precisa verificar a segunda etapa importante do estudo - fluorescência. Mais precisamente, é necessário verificar se o novo reagente C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ suprime os sinais de fluorescência, uma vez que Drosophila já possui baixa fluorescência após manipulações genéticas. Para o teste, as amostras (corpos de Drosophila) foram divididas ao meio: metade não foi tratada, a segunda com tratamento. A análise mostrou que o nível de gravidade do ZFB realmente diminui ao usar C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ , mas isso não afeta a precisão geral. E tudo graças ao fato de que o mesmo reagente permitiu alcançar um alto grau de despigmentação do tecido. Ou seja, as vantagens do reagente nivelaram suas deficiências.

A amostra finalizada deve ser considerada, por assim dizer, e, para isso, foi utilizada a ultramicroscopia avançada para obter uma imagem da amostra com a mesma resolução em todos os planos.


Sistema óptico: 1 e 3 - uma lente cilíndrica asférica plano-convexa; 2 - lente Powell; 4 - abertura macia apodizante elíptica; 5 e 6 - lentes cilíndricas.

Normalmente, a ultramicroscopia padrão usa lentes cilíndricas e uma abertura retangular. Neste estudo, foram utilizados componentes adicionais que alteram a forma do feixe para ultrafino com características aprimoradas.

O uso de lentes esféricas é devido à capacidade de obter uma imagem sem distorção e com mínima aberração.

A abertura padrão também foi alterada para uma abertura suave apodizante elíptica (na imagem acima, no número 4). A nova abertura eliminou a distribuição de intensidade indesejada no sistema óptico.

Resultados da pesquisa

Abaixo estão os sistemas específicos do organismo Drosophila (respiratório, visual, nervoso, etc.) destacados pelo ZFB, enquanto os demais tecidos são completamente despigmentados.

Para não esticar o artigo, escondi tudo sob um spoiler.









Os cientistas, sem hesitação, chamam a maior conquista de sua pesquisa a capacidade de criar um mapa tridimensional completo do sistema nervoso. E se você considerar que esse sistema pertence a um organismo tão pequeno (Drosophila), essa conquista se torna ainda mais significativa.

A nova técnica permite determinar com precisão onde e como esses ou outros neurônios estão conectados, entre si e com o cérebro. Se uma seção transversal fosse usada, isso não teria sido possível.



Como demonstração das capacidades de seu método, os cientistas nos mostram dois tipos de neurônios do sistema visual de Drosophila: DCN - neurônios de cluster dorsal e MCN - neurônios colunares do cérebro (colunas do córtex na parte posterior do cérebro). Na região dorsal-lateral do cérebro, os aglomerados de DCN formam compostos comissurais para excitar os neurônios sinápticos da medula e dos lóbulos no lobo óptico. (imagens acima a , c ).

Nas imagens b e d , é visível a perda de conexão comissural em mutantes homozigotos de células neurais neuroglianas. Essas alterações no sistema nervoso estão associadas precisamente ao processo de purificação de células FlyClear.



Para construir uma reconstrução tridimensional, foram tiradas fotos de duas direções ortogonais, que foram então combinadas. O algoritmo baseado em 3D FFT determina os detalhes de uma amostra que parece mais clara em uma das duas pilhas de imagens. Além disso, tudo isso foi combinado em uma reconstrução tridimensional.

Aqueles que desejam se familiarizar com o estudo com mais detalhes podem ler o relatório dos cientistas e materiais adicionais .

Epílogo

Os cientistas não se vangloriam em vão e se orgulham de seu trabalho, porque isso nunca havia acontecido antes. O método de estratificação por seção transversal foi dominante no campo de pesquisa em organismos. Mas esse método, embora tenha muitas vantagens, possui enormes desvantagens. Em particular, as incisões violam a integridade celular e tecidual, complicando assim o processo de reconstrução de um sistema corporal específico.

Explorar um organismo com um sistema nervoso complexo, quando todos os detalhes são importantes, agora será muito mais fácil. Os cientistas poderão obter mais dados, o que lhes permitirá descrever com mais detalhes esses ou outros processos no corpo.

Além disso, não esqueça que a Drosophila é apenas experimental neste estudo, e não sua base. Melhorar o novo método de digitalização também pode servir à pessoa. E não apenas para estudar o corpo e seus elementos constituintes, mas também para diagnosticar doenças que podem ser ocultadas nos estágios iniciais em que os métodos de digitalização atualmente disponíveis não podem determiná-los.

A pesquisa abre muitas coisas novas: novas espécies de animais, novas substâncias, processos e fenômenos. Mas sem a pesquisa destinada a criar ferramentas de pesquisa, tudo isso seria impossível.


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