Dano para o bem: sistema imunológico de Lamprey na luta contra o câncer no cérebro humano

Nosso cérebro é tudo. A violação do trabalho desse órgão importante leva a consequências terríveis e às vezes fatais. A complexidade do cérebro e sua organização neural são colossais, o que complica muito o processo de tratamento de uma doença específica. Como regra, quando tratamos algo, tentamos nos livrar dos defeitos que a doença causa. Mas e se esses defeitos forem usados ​​para combater o que os cria? É exatamente isso que os autores do estudo que estamos considerando hoje decidiram fazer. Como os cientistas aplicaram a ruptura da barreira hematoencefálica, por que precisamos acessar a matriz extracelular do cérebro e qual o papel da lampreia parasitária nos peixes nisso? O relatório do grupo de pesquisa nos falará sobre isso. Vamos lá

Pouco de teoria

Antes de tudo, vale a pena classificar os personagens nesta peça de laboratório.


Barreira sangue-cérebro

Um dos principais papéis é desempenhado pela barreira hematoencefálica (BBB) ​​- uma barreira fisiológica entre o sistema nervoso central (SNC) e o sistema circulatório. Essa barreira impede o contato dos tecidos nervosos com vários componentes do sangue circulante, entre os quais podem haver toxinas, microorganismos, fatores celulares / humorais do sistema imunológico que podem responder às células do cérebro como estranhas. O BBB pode ser comparado a um segurança em um clube muito caro, deixando entrar no sistema nervoso central exclusivamente nutrientes. Mas esse segurança não é muito exigente, muitas vezes não sente falta dos medicamentos necessários para tratar o sistema nervoso central. Acontece que um sistema que visa o benefício da nossa saúde pode ser um obstáculo ao seu tratamento. Aqui está a ironia na fisiologia.

No entanto, a barreira hematoencefálica nem sempre funciona como um relógio suíço. Em casos de acidente vascular cerebral, tumores, vários ferimentos na cabeça, doenças crônicas, o BBB começa a falhar, ou seja, deixar entrar no sistema nervoso central o que ele teria eliminado anteriormente. Além das causas naturais da falha, também existem agentes antropogênicos: ultra-som de alta intensidade focados e agentes osmóticos que perturbam o BBB. Por que quebrar algo que garante o funcionamento normal do cérebro, você pergunta. Então, para entregar drogas que um BBB completo filtrará. De qualquer forma, o segurança não deixará o médico entrar no clube por um visitante que desmaiou, porque ele não possui um cartão do clube.

Principal e comum a todos os casos, o resultado da ruptura do BBB é uma exposição patológica da matriz extracelular (MEC) do cérebro, que é isolada em condições normais.

A matriz extracelular é a base do tecido conjuntivo que fornece suporte mecânico para as células e o transporte de produtos químicos.

Portanto, os cientistas acreditam que, ao atingir certas partes do cérebro com uma BBB patologicamente perturbada, é possível distribuir medicamentos para as partes do sistema nervoso central danificado que antes eram inacessíveis precisamente por causa da BBB.

Assim, é possível criar um ligante voltado para a MEC, o qual será eficaz no combate a várias doenças do sistema nervoso central, e não a uma específica, como métodos previamente desenvolvidos.

Para testar a teoria na prática, os cientistas decidiram aplicar seu método de administração de medicamentos ao glioblastoma incurável (câncer no cérebro). Este tipo de doença é bastante raro, mas é extremamente difícil de derrotar. Mesmo após quimioterapia, radioterapia e cirurgia, a sobrevivência é de cerca de 1-2 anos.

Estudos recentes demonstraram que o uso da imunoterapia através de receptores de antígeno quiméricos à base de interleucina-13 * é um tratamento promissor para o glioblastoma.

As interleucinas * são moléculas de informação peptídica produzidas por leucócitos, em menor grau por fagócitos e outros tecidos. As interleucinas fazem parte do sistema imunológico.

A interleucina-13 * (IL13) é o principal mediador das alterações fisiológicas causadas pela inflamação alérgica em muitos tecidos.

O receptor quimérico de antígeno * é uma proteína de fusão recombinante que conecta um fragmento de anticorpo que pode se ligar seletivamente a antígenos específicos e domínios de sinalização que ativam células T.

O uso de receptores antigênicos quiméricos direcionados à proteína CSPG4 também pode ser um método bastante eficaz de combate ao glioblastoma.

Além disso, a análise por ressonância magnética mostrou uma violação da barreira hematoencefálica no glioblastoma. Portanto, tratamentos relacionados à matriz extracelular devem ser eficazes.

E aqui entra a imensa imaginação e criatividade dos cientistas. O fato é que você pode usar peptídeos e anticorpos padrão como reagentes direcionados à ECM, mas isso não é tão divertido. Portanto, os cientistas decidiram usar receptores de linfócitos variáveis ​​(VLR), ou seja, lampreias receptores de antígeno.


A classe da lampreia tem cerca de 40 espécies, a maioria das quais são parasitas que se alimentam do sangue dos peixes, para os quais sugam.

As VLRs são proteínas ricas em foice e leucina que reconhecem alvos antigênicos com especificidade e afinidade * comparáveis ​​aos anticorpos à base de imunoglobulina.

Afinidade * é a característica termodinâmica da força da interação de substâncias como antígeno e anticorpo.

Por que exatamente lampreias e seus VLR? O fato é que, entre mamíferos e lampreias, existe um abismo evolutivo de 500 milhões de anos. Assim, as VLRs da lampreia têm maior probabilidade de reconhecer proteínas e glicanos conservados na MEC do que os anticorpos de mamíferos.

Para identificar os VLRs que ligam o ECM do cérebro, os cientistas realizaram o pan, um método para selecionar bioelementos específicos (proteínas, petites etc.) das bibliotecas VLR de biomoléculas. O resultado foi um conjunto de clones de ligação a ECM * .

Clone * - um grupo de células idênticas que compartilham um ancestral comum (fonte primária), ou seja, provêm da mesma célula.

O clone resultante demonstrou acúmulo preferencial tanto em áreas destruídas da barreira hematoencefálica em animais com um distúrbio osmótico da BBB ou com glioblastoma. Além disso, o clone era bem direcionado para lipossomos * carregados com doxorrubicina (um antibiótico).

Lipossomas * - organelas intracelulares esféricas usadas para administrar medicamentos a certos tecidos.

Preparação do estudo

Como já aprendemos anteriormente, as VLRs de ligação ao ECM foram identificadas através da seleção de bibliotecas VLR. A própria biblioteca foi obtida a partir de uma coleção de VLRs de lampreia imunizadas com preparações mecanicamente isoladas da membrana plasmática da microvasculatura do cérebro de camundongos, que continham a MEC associada ao cérebro.

A biblioteca foi primeiro enriquecida com ligantes de ECM utilizando dois ciclos de panning em um * ECM descelularizado gerado por células endoteliais de camundongo cultivadas (linha celular bEnd.3).

A descelularização * é um método de purificação de aloenxertos do componente celular para obter uma construção não imunogênica, eficaz e segura com base em uma matriz extracelular natural.

Além disso, foi necessário identificar exatamente aqueles clones de ligação a ECM que dobram predominantemente o ECm bEnd.3, e não com o grupo controle de ECMs de fibroblastos de camundongo (linha celular 3T3).

Em seguida, os clones individuais foram colocados em placas de 96 poços, após o que foram expandidos e induzidos a exibir VLR. Após a remoção de clones extras (para que não houvesse subclonagem), os cientistas foram capazes de realizar uma avaliação comparativa da ligação de VLR ao bEnd.3 e 3T3 ECM usando a triagem ELISA ( 1a ).


Imagem Nº 1

Um total de 285 clones foram analisados. Como resultado, pode-se observar que os sinais de comunicação com bEnd.3 ECM são aproximadamente 5 vezes mais fortes que os sinais de comunicação com 3T3 ECM ( 1b ).

Em seguida, os resultados do ELISA foram verificados através da comparação de imagens de microscopia de campo claro de clones associados a bEnd.3 e 3T3 ECM ( 1C ).

Como pode ser visto na imagem 1c , os clones P1C10 e P2C7 se ligam exclusivamente ao bEnd.3 ECM, e o clone não ligado P1E9 praticamente não mostra nenhuma conexão com nenhum tipo de ECM.

Em seguida, os cientistas realizaram uma análise comparativa de um método mais prático - em uma seção do cérebro do rato. Oito dos 10 clones de VLR que mostraram o melhor resultado de ligação em observações anteriores também mostraram ligação ( 1d ) neste ensaio.

Todos os clones de ligação mostraram um esquema EMC parenquimatoso difuso sem qualquer enriquecimento adicional (vascular ou celular).

Os cientistas identificaram 2 líderes de acordo com os resultados de todas as observações acima - P1C10 e P3A8. São esses clones que serão considerados no futuro.

Resultados da pesquisa

P1C10 e P3A8 foram funcionalizados com corante fluorescente Cy5. A imunocoloração direta de tecidos murinos usando conjugados VLR-Cy5 mostrou que P1C10-Cy5 possui seletividade significativa em relação à MEC do cérebro em comparação com tecidos dos rins, coração e fígado ( 2a ).


Imagem No. 2a

Imunocoloração * - um processo que permite identificar e localizar um antígeno em uma área específica de uma célula, tecido ou órgão.

Mas o P3A8-Cy5 se liga aos ECMs do cérebro e do fígado com a mesma intensidade, mas, como o P1C10-Cy5, não mostra interesse nos ECMs dos rins e do coração.

Em seguida, os cientistas testaram a reatividade cruzada do P1C10 e o ECM do cérebro humano (foram usadas criosseções). A ligação de P1C10-Cy5 ao ECM do cérebro humano assemelha-se a uma imagem do mesmo processo, mas envolvendo o cérebro de camundongo ( 2b ). O P1C10-Cy5 também se ligou com sucesso ao ECM nas criosseções de uma amostra de glioblastoma humano ( 2c ).


Imagem No. 2b-e

Dadas essas observações, os cientistas mediram a afinidade de * P1C10.

Afinidade * - a capacidade de uma célula de capturar e ligar certos produtos químicos.

Como resultado, a constante de dissociação (Kd) para ligação a bEnd.3 ECM foi de 48,38 ± 6,05 nM ( 2d ).

Depois disso, os cientistas decidiram verificar se o P1C10 se acumularia nos locais de destruição do BBB no cérebro do mouse.

Modificado pelo corante próximo aos clones IR800 P1C10 ou RBC36 do infravermelho foram introduzidos em camundongos de laboratório saudáveis ​​em um volume de 1 mg / kg O RBC36 é um VLR que reconhece o trissacarídeo do antígeno H humano, razão pela qual foi usado como controle de isótipo.

Em seguida, os ratos foram injetados por via intravenosa com manitol (álcool hexahídrico) para abrir temporariamente o BBB. Depois disso, imagens cerebrais foram tiradas de camundongos para identificar sinais IR800 (imagem abaixo).


Imagem No. 3

Uma análise comparativa mostrou que o acúmulo de fluorescência no cérebro (concentração da substância de teste marcada com o corante IR800) ao usar P1C10-IR800 é 3,3 vezes maior que com RBC36-IR800 e 7,6 vezes maior que com solução salina. Consequentemente, o P1C10 se acumula seletivamente no cérebro após um mau funcionamento da barreira hematoencefálica.

Em seguida, os cientistas decidiram verificar se o VLR atingiria a matriz extracelular nua. Para isso, dois modelos foram criados usando células murinas GL261 e glioblastoma U87 humanas, que foram introduzidas no cérebro de camundongos experimentais. Como resultado, os tumores foram formados com uma vasculatura caótica e distúrbios pontuais da barreira hematoencefálica.

P1C10 ou RBC36 em um volume de 1 mg / kg foi administrado por via intravenosa a camundongos com glioblastoma GB261 incorporado. Após 30 minutos, amostras do cérebro foram coletadas para analisar e visualizar o sinal IR800 (corante para P1C10 ou RBC36).


Imagem No. 4

A intensidade média de fluorescência na região tumoral de GL261 em camundongos injetados com P1C10-IR800 foi 112 vezes maior que na região contralateral (oposta) do cérebro ( 4a ). Porém, ao usar o RBC36-IR800, a intensidade de fluorescência da região do tumor foi apenas 9 vezes maior que a intensidade na região oposta.

Além disso, verificou-se que o acúmulo de P1C10-IR800 no próprio tumor é 13 vezes maior que o acúmulo de RBC36-IR800.

Essas observações confirmaram a capacidade de P1C10 de atingir seletivamente a MEC em tumores de camundongo. Agora era necessário testar esse talento em tumores cerebrais humanos.

A VLR foi administrada a camundongos com U87 (tumor cerebral humano). Os cientistas testaram não apenas o P1C10, mas também o 192, que mostraram ligação seletiva ao lado basolateral da vasculatura do cérebro, além dos vasos dos rins e do fígado, além do ECM.

P1C10, 192 ou RBC36 em um volume de 3 mg / kg foi administrado por via intravenosa e deixou-se circular livremente por 30 minutos. Depois disso, foram coletadas amostras de órgãos de interesse para visualizar os resultados.

Ambos os clones de VLR (P1C10 e 192) mostraram acúmulo nas bordas do tumor, com P1C10 sendo distribuído por todo o ECM do tumor ( 4b ). Mas 192 na maior parte estava concentrado fora dos grandes vasos tumorais.

Nenhum dos clones de VLR acumulou-se no hemisfério contralateral saudável do cérebro de camundongo. E o RBC36 estava completamente ausente tanto nas partes saudáveis ​​quanto nas partes do cérebro que continham tumores.

A análise quantitativa mostrou que o P1C10 se acumula no tumor U87 21,2 vezes mais do que na região contralateral do cérebro, 21,2 vezes nos rins, 15,9 vezes no fígado e 29,6 vezes no coração.

O acúmulo de P1C10 e 192 nas regiões tumorais foi 25,4 e 11,9 vezes maior que o acúmulo de hemácias36. Ao mesmo tempo, ambos os clones de VLR se acumularam principalmente nas áreas de defeitos vasculares do tumor.

Essas observações confirmam a eficácia do P1C10 e seu foco seletivo na MEC do cérebro. Resta saber se o P1C10 pode fornecer medicamentos com eficiência para onde eles precisam.

Os cientistas usaram a VLR em conjunto com lipossomas carregados de doxorrubicina, que são visualizados altamente graças à sua própria fluorescência, o que simplifica bastante o processo de análise da eficácia da VLR. Os lipossomas foram obtidos com um diâmetro médio de 94,2 nm e um conteúdo de doxorrubicina de 1 a 2 mg / ml. Em seguida, os clones de VLR foram anexados aos lipossomas, que mantiveram sua atividade de ligação após a combinação (imagem nº 5).


Imagem No. 5

Para demonstrar a viabilidade do tratamento com lipossomas carregados com doxorrubicina direcionados a VLRs, células U87 tumorais (cultivadas em bEnd.3 ECM) foram incubadas com lipossomas carregados com doxorrubicina direcionados a P1C10 ou RBC36.

As observações mostraram um crescimento significativo nas células destruídas pelos lipossomas direcionados ao P1C10. A concentração efetiva semi-máxima foi de 199,0 ± 1,7 nM para P1C10 e 3312,0 ± - 2,6 para RBC36.


Imagem Nº 6

E, finalmente, os cientistas testaram a utilidade terapêutica potencial de atingir uma matriz extracelular patologicamente danificada do cérebro. Para isso, lipossomos carregados com doxorrubicina em combinação com P1C10, 192 ou RBC36 foram utilizados em camundongos experimentais com células cancerígenas U87.

Como pode ser visto nas imagens 6a e 6b , o sinal da doxorrubicina é muito mais forte ao usar P1C10. Pode-se observar que esse sinal está suficientemente localizado no tumor e não afeta a região contralateral (saudável) do cérebro.

As figuras 6c e 6d demonstram que o acúmulo de P1C10 na região do tumor é 7,6 vezes maior que na região saudável. Se compararmos o grau de acumulação de P1C10 com o RBC36, a diferença é de 7,9 vezes a favor do P1C10.

Por 4 semanas (nos dias 7, 14, 21 e 28), 12 mg / kg de doxorrubicina foram administrados a camundongos experimentais com U87 usando P1C10, 192 ou RBC36.

Após a introdução do tumor, a sobrevida média foi de 43 dias para P1C10, 30 dias para 192 e 28 dias para RBC36.

Um grupo de indivíduos com P1C10 mostrou um aumento significativo na sobrevida em comparação com os outros dois grupos. Ao mesmo tempo, os indicadores 192 e RBC36 não diferem significativamente dos indicadores dos grupos de controle que não receberam tratamento.

Para um conhecimento mais detalhado das nuances do estudo, recomendo que você analise o relatório dos cientistas .

Epílogo

Não haveria felicidade, mas o infortúnio ajudou. Com esta frase, você pode descrever com precisão esse estudo. Os cientistas usaram distúrbios patológicos da barreira hematoencefálica como uma ferramenta para administrar medicamentos a certas áreas do cérebro afetadas por um tumor, evitando áreas saudáveis. E os cientistas receberam ajuda nesse empreendimento complexo e nobre, como dizem, de onde não esperaram. Lampreias de linfócitos receptores variáveis ​​(VLR) tornaram-se a base deste trabalho. Agora é seguro dizer que até parasitas podem ser úteis.

O tratamento de tumores cerebrais é repleto de uma enorme lista de dificuldades, e o sucesso desse processo não é tão bom quanto gostaríamos. A criação de novos métodos e meios para combater doenças tão graves é realmente o que a ciência existe. , , , .


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