Microbiota. História dos métodos de estudo e pesquisa

Recebemos muitos comentários sobre o último artigo e decidimos com a Atlas suplementar a série com material sobre quais são os outros métodos de estudo da microbiota. No final do artigo, eles acrescentaram que você precisa se lembrar dos estudos de bactérias intestinais hoje para que eles não prejudiquem sua saúde.


Ilustração de Rentonorama

Como começou o estudo da microbiota?

A microbiota intestinal é chamada de novo órgão no corpo humano. Conhecemos mais ou menos outros órgãos há muito tempo, mas só se tornou conhecido no final do século XX que as bactérias desempenham funções importantes para os seres humanos. O estudo da microbiota começou no século XVII. O criador do microscópio e o "pai da microbiologia", Anthony Van Levenguk, primeiro examinou e descreveu bactérias na cavidade oral e nas fezes.

Em 1828, Christian Ehrenberg introduziu o novo termo Bactéria. Naquele momento, ele estudava Escherichia coli (Escherichia coli), uma espécie de bactéria sem esporos. Para bactérias formadoras de esporos, Christian cunhou o termo Bacillus. Este tipo de bactéria foi estudado ativamente por Robert Koch. Ele também revelou a relação entre representantes patogênicos desse gênero e doenças como antraz e tuberculose.

Já no século 19, os pesquisadores entendiam que a saúde humana está intimamente ligada às bactérias. No entanto, o estudo completo da microbiota tornou-se possível após a descoberta da tecnologia de seqüenciamento de genes por Frederick Senger. Nem todas as espécies são capazes de viver e crescer em placas de Petri, por isso era difícil classificar e determinar as funções das bactérias em detalhes.

Juntamente com o desenvolvimento da tecnologia nos anos 70, o microbiologista Karl Vöze propôs a classificação de microrganismos com base no seqüenciamento da molécula de rRNA 16s, o que torna conveniente comparar sequências de nucleotídeos e determinar o grau de afinidade. Segundo a análise, Karl dividiu todos os microrganismos em arquéias, bactérias e eucariotos. Esta classificação é usada agora.



Os eucariotos se distinguem pela presença de um núcleo, mas as bactérias e as arquéias não. As arquéias são simples microorganismos unicelulares que vivem em condições extremas (em gêiseres, no fundo dos mares e oceanos). E eles são os mais antigos: as arquéias existem na Terra por cerca de 4 bilhões de anos. Além disso, entre eles não existem microrganismos parasitas e patogênicos, e entre as bactérias existem, embora não tantos quanto pensamos - cerca de 1%.

No intestino humano, as arquéias produzem metano. Além disso, quanto mais existem, menor o risco de obesidade, mas a relação causal permanece incerta. Nem todos têm archaea e raramente vão além de 1-2%.

As bactérias vivem em uma ampla variedade de ambientes e entramos em contato com elas muito mais do que com arquéias. Eles diferem em várias funções. Por exemplo, as bactérias podem quebrar as moléculas de carboidratos e produzir ácidos graxos, enquanto as arquéias não podem.

Como estudar microbiota

Antes de mergulhar na pesquisa, vamos primeiro atualizar nosso conhecimento de síntese de DNA, RNA e proteínas.

O corpo precisa de proteínas para funcionar corretamente. Os tecidos da pele, a fim de manter uma função protetora, requerem uma; as células dos olhos, para que o órgão funcione corretamente, são diferentes. Às vezes, células e tecidos diferentes requerem a mesma proteína. Para criar proteínas, as células usam o DNA como uma instrução.

Primeiro, é determinada a área em que as informações necessárias estão contidas. O DNA de fita dupla é desenrolado e apenas um lado é copiado. Então o DNA é revertido e uma cópia de um de seus lados (RNA) capta o ribossomo. Ela lê a sequência e constrói nela uma cadeia de aminoácidos, que então toma forma e se torna uma proteína.

Isso pode ser comparado à culinária de acordo com um livro de receitas antigo. Primeiro, escrevemos uma receita para não usar novamente o livro frágil, mas valioso. Mais adiante na receita, combinamos diferentes produtos, como o ribossomo de aminoácido, para obter o prato final. Para uma célula, um prato é uma proteína que ele usa ainda mais para suas necessidades. Além da proteína, os microorganismos produzem outros compostos, como ácidos graxos, que são considerados metabólitos.

Para estudar microorganismos, quatro abordagens são usadas principalmente: pesquisa metagenômica - DNA, pesquisa metatranscriptômica - RNA, metaproteômica - pesquisa de proteínas, metabolômica - pesquisa de metabólitos.

Sequenciação metagenômica

Metagenoma - um conjunto de genes de todos os organismos no ambiente estudado. A essência desta análise está no sequenciamento do gene rRNA 16s, responsável pela operação do RNA ribossômico ou no sequenciamento de todo o DNA. Esse estudo responde às perguntas "que organismos estão na amostra e que funções eles potencialmente desempenham?" Falamos sobre essa tecnologia em detalhes em um artigo anterior, uma vez que o teste "Microbiota Genetics" foi construído nela.

Geralmente, a pesquisa de microbiota se refere a esse tipo específico de análise, porque foi a primeira a ser usada em larga escala no estudo de bactérias. Após o advento da tecnologia de seqüenciamento de DNA, os cientistas lançaram um projeto global para estudar solos, mares e fontes termais. Graças à análise metagenômica, o banco de dados de microrganismos cresceu exponencialmente. O seqüenciamento permite que você estude bactérias em um ambiente natural, enquanto em condições de laboratório, muitas delas morrem.



Em 2007, pesquisadores dos EUA iniciaram um projeto para estudar o microbioma do corpo humano Human Microbiome Project . Tornou-se o ímpeto para um estudo em larga escala da composição de bactérias intestinais com base em dados metagenômicos. Após o HMP na Europa em 2008, lançou um projeto semelhante para estudar a microbiota humana - MetaHit .

A essência dos estudos metagenômicos é entender quais microorganismos vivem na amostra, quantos existem e quais funções eles desempenham. A análise não avalia diretamente quais compostos a comunidade bacteriana produz. No entanto, graças a muitos estudos metagenômicos, podemos prever isso indiretamente. Por exemplo, se uma pessoa tem mais produtores de bactérias do ácido butírico - sua microbiota provavelmente a produz bem.

Os estudos metagenômicos são difundidos porque são mais fáceis de realizar em comparação com outros métodos. O estudo de RNA, proteínas e metabolitos requer purificação sofisticada da amostra e análises mais demoradas.

De acordo com dados metagenômicos, temos mais resultados. Isso é claramente visto com base em todos os artigos científicos e pesquisas clínicas PubMed. Uma pesquisa por microbioma metagenômico retorna cerca de 4.500 artigos diferentes, uma consulta de microbioma metatranscriptômico total 225, microbioma metaproteômico 100, microbioma metabólico 1.600.

Sequenciamento de metatranscriptoma

Uma transcrição é a totalidade de todas as moléculas de RNA mensageiro (mRNA) que uma única célula ou grupo de microorganismos sintetiza. Na análise do metatranscriptoma, o RNA é estudado diretamente, e não o gene que o codifica.

Acontece que existe uma bactéria, mas não participa da vida da comunidade microbiana: possui genes inativos que não são copiados pela molécula de RNA. Estudos de metatranscriptoma nos permitem avaliar exatamente a parte ativa da microbiota. No entanto, a molécula de RNA não é tão estável quanto o DNA e decai rapidamente. Portanto, é mais difícil e mais caro isolá-lo e salvá-lo para análise.



Frequentemente, estudos de transcriptoma são usados ​​para estudar certas funções genéticas. Nesse caso, os resultados de um teste de RNA são verificados contra dados metagenômicos. Portanto, os cientistas obtêm informações mais completas sobre o trabalho dos microrganismos. Os estudos de metatranscriptoma de microbioma podem ser úteis para determinar com maior precisão o potencial de síntese de vários metabólitos.

Metaproteômica

Com essa abordagem, todas as proteínas presentes na amostra são estudadas. A metaproteômica fornece informações sobre a estrutura, funções e dinâmica da comunidade microbiana. Os cientistas aprenderão mais sobre como os organismos interagem entre si, competem pela nutrição e produzem metabólitos.

Primeiro, as proteínas são isoladas da amostra. Freqüentemente, a cromatografia líquida é usada para isso. Em seguida, uma análise adicional é realizada para determinar o peso molecular - espectrometria de massa. Então, obtemos informações sobre fragmentos de proteínas (peptídeos), mas não sobre toda a proteína. Para coletar os fragmentos em um único todo, são usados ​​programas especiais e os cientistas recebem dados prontos.



Atualmente, a metoproteômica é menos popular que os estudos de DNA e RNA. Isso se deve à complexidade da pesquisa e à alta probabilidade de erro. Uma amostra pode conter muitas proteínas humanas ou alimentares. No entanto, a metaproteômica pode ajudar os cientistas a esclarecer as interações entre bactérias e a perturbação da microbiota em pessoas com doenças.

Metabolômica

Com esse tipo de análise, os metabólitos são estudados - substâncias que as bactérias produzem. Estes podem ser aminoácidos, lipídios, açúcares, ácidos graxos (incluindo ácido butírico) e outros compostos. Agora, cerca de 40.000 metabólitos do corpo humano são descritos e todos são registrados em um grande banco de dados .



Como amostra para o estudo de metabólitos, você pode usar qualquer fluido do corpo humano: sangue, saliva, urina, lavagem intestinal (rubor) e até líquido cefalorraquidiano. Em média, cerca de 4200 metabólitos estão contidos no plasma sanguíneo, 3000 na urina, 500 líquido cefalorraquidiano e 400 na saliva.No entanto, a lavagem é usada como biomaterial para estudos de microbiota.

O procedimento de estudo do metabolito é semelhante à análise de proteínas. Utilizando a mesma cromatografia em fase líquida ou gasosa, os metabólitos são primeiro isolados e, em seguida, seu peso molecular é medido usando um espectrômetro de massa.

O estudo dos metabólitos tem suas limitações. Por exemplo, com base neste estudo, não conseguimos descobrir exatamente quais metabólitos são excretados pela microbiota intestinal e quais recebemos com alimentos.



Além disso, é impossível calcular quantas bactérias estão contidas na microbiota. Portanto, para uma imagem mais completa, os dados sobre os metabólitos são acompanhados pelos resultados das análises metagenômicas. Essa abordagem às vezes é usada para estudar como a microbiota e seus metabólitos estão envolvidos no desenvolvimento de doenças.

O que lembrar

Até o momento, nenhum método de pesquisa de microbiota foi utilizado na prática clínica regular. Às vezes, para uma imagem completa, o médico pode recomendar a realização de um estudo metagenômico da microbiota para avaliar a composição das bactérias intestinais.

Avisamos aos usuários que o teste Microbiota Genetics é apenas para fins educacionais e foi desenvolvido para pessoas saudáveis ​​que estão interessadas em conhecer suas bactérias. Se uma pessoa estiver doente, ela poderá descobrir a composição da bactéria, mas as recomendações nesse caso não serão relevantes. A microbiota das pessoas com doenças é muito diferente e, para elas, o perfil “normal” será diferente.

Não aconselhamos as crianças a conduzir o estudo, porque seus dados de microbiota são muito menores. E a intervenção desnecessária e a limitação da dieta das crianças de acordo com os resultados do estudo são potencialmente perigosas, uma vez que a criança pode não receber os nutrientes necessários ou sofrer de sobrediagnóstico.

Atualmente, é oferecido aos residentes da Rússia e dos países da CEI um estudo dos metabólitos da microbiota para crianças e adultos, utilizando uma amostra de sangue ou saliva por cromatografia gasosa e espectrometria de massa. De acordo com seus resultados, de acordo com os desenvolvedores deste método, é possível avaliar a presença e ausência de inflamação no organismo.

No entanto, não existem recomendações nas diretrizes clínicas internacionais. O diagnóstico de inflamação e doença deve ser realizado por métodos com alto nível de evidência, certo grau de sensibilidade, baixa probabilidade de resultados falso-positivos e complicações de sobrediagnóstico.

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