Laureada com o Prêmio Nobel Carey Mullis - Inventora da reação em cadeia da polimerase de DNA

Na Califórnia, aos 74 anos, o Prêmio Nobel de Química em Carey Mullis morreu. Segundo sua esposa, a morte ocorreu em 7 de agosto. O motivo é insuficiência cardíaca e respiratória devido a pneumonia.

James Watson, o descobridor da molécula de DNA, nos falará sobre sua contribuição à bioquímica e sobre o que recebeu o Prêmio Nobel.

Trecho do livro de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis

DNA A história da revolução genética

Capítulo 7. O genoma humano. Roteiro de vida

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A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi inventada em 1983 pelo bioquímico Cary Mullis, que trabalhou na Cetus. A descoberta dessa reação foi bastante notável. Mullis lembrou mais tarde: “Uma vez em uma noite de sexta-feira em abril de 1983, pareceu me iluminar. Eu estava dirigindo, percorrendo uma estrada sinuosa e iluminada pela lua até o norte da Califórnia, à beira das florestas de sequóias. É impressionante que tenha sido em tal situação que ele foi visitado por inspiração. E não é de todo que, no norte da Califórnia, haja estradas especiais que promovam insights; só que seu amigo viu Mullis correndo de forma imprudente por uma estrada de mão dupla e gelada e isso não o incomodou. Um amigo disse ao New York Times o seguinte: “Mullis sonhava que ele morreria se chocando com sequóias. Portanto, ele não tem medo de dirigir nada se as sequóias não crescerem ao longo da estrada. ” A presença de sequóias ao longo da estrada fez Mullis se concentrar e ... aqui está, um insight. Por sua invenção em 1993, Mullis recebeu o Prêmio Nobel de química e, desde então, tornou-se ainda mais estranho em suas ações. Por exemplo, ele é um defensor da teoria revisionista de que a AIDS não está relacionada ao HIV, o que prejudicou significativamente sua própria reputação e impediu médicos.

A PCR é uma reação bastante simples. Para isso, precisamos de dois primers quimicamente sintetizados complementares às extremidades opostas das diferentes cadeias do fragmento de DNA desejado. Primers são seções curtas de DNA de fita simples, cada uma com aproximadamente 20 pares de bases. A peculiaridade dos primers é que eles correspondem às regiões do DNA que você deseja ampliar, ou seja, o modelo do DNA.


(Imagem clicável) Cary Mullis, inventora da PCR

A especificidade da PCR baseia-se na formação de complexos complementares entre a matriz e os iniciadores, oligonucleotídeos sintéticos curtos. Cada um dos iniciadores é complementar a uma das cadeias da matriz de fita dupla e limita o início e o fim da região amplificada. De fato, a “matriz” resultante representa um genoma inteiro, e nosso objetivo é isolar dele fragmentos de interesse. Para isso, o modelo de DNA de fita dupla é aquecido a 95 ° C por vários minutos, para que as cadeias de DNA sejam dispersas. Esse estágio é chamado de desnaturação, pois as ligações de hidrogênio entre as duas cadeias de DNA são destruídas. Quando as correntes estão abertas, a temperatura é reduzida para que os primers possam entrar em contato com o modelo de corrente única. A polimerase de DNA inicia a replicação do DNA pela ligação a um comprimento de uma cadeia de nucleotídeos. A enzima DNA polimerase replica a cadeia modelo usando um primer como exemplo de semente ou cópia. Como resultado do primeiro ciclo, obtemos dupla duplicação seqüencial de uma região específica do DNA. Em seguida, repetimos esse procedimento. Após cada ciclo, obtemos a área alvo em quantidade dupla. Após vinte e cinco ciclos de PCR (ou seja, em menos de duas horas), temos uma região de DNA de interesse em uma quantidade 225 vezes maior que a original (ou seja, amplificamos cerca de 34 milhões de vezes). De fato, na entrada, temos uma mistura de primers, DNA modelo, enzima DNA polimerase e bases livres A, C, G e T, a quantidade de produto de reação específico (limitado por primers) cresce exponencialmente, e o número de cópias "longas" de DNA é linear, portanto produtos de reação dominam.


Amplificação de um local de DNA desejado: reação em cadeia da polimerase

No início da PCR, o principal problema era o seguinte: após cada ciclo de aquecimento-resfriamento, a polimerase de DNA precisava ser adicionada à mistura de reação, uma vez que era inativada a 95 ° C. Portanto, foi necessário adicioná-lo novamente antes de cada um dos 25 ciclos. O procedimento de reação foi relativamente ineficaz, exigiu muito tempo e a enzima polimerase, e o material é muito caro. Felizmente, a mãe natureza veio em socorro. Muitos animais se sentem confortáveis ​​em temperaturas bem acima de 37 ° C. E por que o número de 37 ° C se tornou importante para nós? Isso aconteceu porque esta temperatura é ideal para E. coli, da qual a enzima polimerase para PCR foi originalmente obtida. Na natureza, existem microorganismos cujas proteínas se tornaram mais resistentes a altas temperaturas ao longo de milhões de anos de seleção natural. Foi proposto o uso de polimerases de DNA de bactérias termofílicas. Essas enzimas eram termoestáveis ​​e foram capazes de suportar muitos ciclos de reação. Seu uso tornou possível simplificar e automatizar a PCR. Uma das primeiras polimerases de DNA termoestáveis ​​foi isolada da bactéria Thermus aquaticus, que vive nas fontes termais do Parque Nacional de Yellowstone e é chamada polimerase Taq.

A PCR rapidamente se tornou a principal força de trabalho do projeto Human Genome. Em geral, o processo não difere do desenvolvido por Mullis, foi apenas automatizado. Não dependíamos mais da multidão de estudantes de pós-graduação cegos, meticulosamente derramando gotículas de líquido em tubos de plástico. Nos laboratórios modernos que realizam pesquisa genética molecular, este trabalho é realizado em transportadores robóticos. Os robôs de PCR envolvidos em um projeto de sequenciamento em larga escala como o genoma humano estão trabalhando incansavelmente com grandes volumes de polimerase resistente ao calor. Alguns cientistas que trabalham no projeto Human Genome ficaram indignados com as contribuições injustificadamente altas que o detentor da patente de PCR, a gigante industrial e farmacêutica européia Hoffmann-LaRoche, acrescenta ao custo dos consumíveis.

Outra "força motriz" foi o próprio método de seqüenciamento de DNA. A base química desse método na época não era mais uma novidade: o Genoma Humano do Projeto Interestadual (HGP) adotou o mesmo método engenhoso que Fred Senger desenvolveu em meados da década de 1970. A inovação estava na escala e no grau de automação alcançados durante o seqüenciamento.

O sequenciamento automático foi originalmente desenvolvido no laboratório de Lee Hood no Instituto de Tecnologia da Califórnia. Ele se formou no colegial em Montana e jogou futebol americano como atacante; graças a Hood, a equipe venceu o campeonato estadual mais de uma vez. As habilidades de trabalho em equipe foram úteis para ele em sua carreira científica. O laboratório de Hood empregava uma empresa heterogênea de químicos, biólogos e engenheiros, e logo seu laboratório se tornou líder em inovação tecnológica.

De fato, o método de seqüenciamento automático foi inventado por Lloyd Smith e Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, que então trabalhava no laboratório de Hood, procurou Lloyd Smith, oferecendo a ele um método de seqüenciamento aprimorado, no qual as bases de cada tipo seriam pintadas em sua própria cor. Tal ideia poderia quadruplicar a eficácia do processo de Senger. Sanger, ao sequenciar em cada um dos quatro tubos (de acordo com o número de bases) com a participação da polimerase de DNA, forma um conjunto único de oligonucleotídeos de diferentes comprimentos, incluindo uma sequência de primers. Em seguida, a formamida foi adicionada aos tubos para separar as cadeias e a eletroforese em gel de poliacrilamida foi realizada em quatro faixas. Na variante Smith e Hunkapiller, os didesoxinucleotídeos são marcados com quatro corantes diferentes e a PCR é realizada em um tubo. Então, durante a eletroforese em gel de poliacrilamida, um raio laser em um local específico no gel excita a atividade dos corantes, e o detector determina qual nucleotídeo está migrando atualmente através do gel. No início, Smith era pessimista - ele temia que o uso de doses ultra-baixas do corante levasse ao fato de que as regiões nucleotídicas seriam indistinguíveis. No entanto, sendo versado em tecnologias a laser, ele logo descobriu uma saída usando corantes fluorocromáticos especiais que fluorescem sob a influência da radiação laser.


(Versão completa por clique - 4,08 MB) Letras pequenas: sequência de DNA decodificada usando um seqüenciador automático obtido a partir de uma máquina de seqüenciamento automático. Cada cor tem uma das quatro bases.

Na versão clássica do método de Sanger, uma das cadeias do DNA analisado atua como uma matriz para a síntese de uma cadeia complementar pela enzima DNA polimerase, então a sequência de fragmentos de DNA é classificada por tamanho em um gel. Cada fragmento incluído no DNA durante a síntese e subsequentemente permite a visualização dos produtos da reação é marcado com um corante fluorescente correspondente à base do terminal (isso foi discutido na página 124); portanto, a fluorescência deste fragmento será um identificador para uma dada base. Resta apenas realizar a detecção e visualizar os produtos da reação. Os resultados são analisados ​​usando um computador e apresentados como uma sequência de picos multicoloridos correspondentes a quatro nucleotídeos. Além disso, as informações são transmitidas diretamente ao sistema de informações do computador, o que elimina o processo de entrada de dados demorado e às vezes doloroso, o que dificulta muito o sequenciamento.

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