Matemática revela segredos do feedback de células vivas

Manter a estabilidade ideal com base no feedback negativo é um elemento básico dos circuitos elétricos; no entanto, até agora, permaneceu um mistério como as células vivas conseguem fazer isso.

Mustafa Hammash, um pequeno robô Lego, é apaixonado por brincar de espiar com um livro que fica a 30 cm à sua frente. Hammash empurra o livro para frente e o robô imediatamente começa a zumbir com suas quatro rodas para segui-lo; ele aproxima o livro e o robô volta, permanecendo a uma distância de 30 cm do livro. Hammash pressiona o carro com óculos, inclina a mesa em um ângulo, substitui as rodas por outras, 30% a mais - e cada vez que o robô restaura a zona de amortecimento de 30 cm entre o livro e começa a olhá-lo novamente.

A estranha capacidade do robô de ajustar sua localização fornece o que os biólogos chamam de adaptação ideal estável. "Quando o movimento termina, não há erros", disse Hammash, especialista em teoria da administração do Instituto Estadual de Tecnologia da Suécia, em Zurique. - Esta é uma adaptação perfeita; mantém perfeitamente a distância ".

Sejam sistemas de controle industrial ou vida selvagem, o feedback negativo (OOS) é uma estratégia onipresente que ajuda os sistemas a lidar com distúrbios. "As pessoas notaram a existência de tais sistemas de feedback em fisiologia desde que começaram a estudar fisiologia", diz Noah Olsman, especialista em teoria da administração na Universidade de Harvard. A homeostase, a auto-regulação de sistemas biológicos, mantém muitos parâmetros fisiológicos, por exemplo, temperatura corporal, pressão e nível de glicose no sangue, em uma estrutura clara - seja uma maratona, um mergulho com equipamento de mergulho ou uma exibição contínua de programas de TV durante todo o dia. E não em vão: "Se a vida não pudesse reagir às mudanças e aprender, não duraria muito", disse Olsman.


O robô demonstra uma adaptação ideal constante, mantendo uma distância constante ao alvo, um livreto em movimento. Esse comportamento é impossível sem feedback negativo no qual um controlador chamado "integrador" está envolvido

Mas, apesar da importância desse feedback para a vida, era muito difícil para os biólogos explicar como exatamente as células e os organismos mais complexos realizam os sistemas operacionais com uma resposta rápida e precisa. E apenas nas últimas duas décadas, os cientistas conseguiram derivar alguns princípios básicos. Um avanço importante aconteceu no verão passado, quando Hammash demonstrou um sistema OS artificial que pode ser instalado nas células para ajudá-los a se adaptarem perfeitamente a distúrbios, assim como um robô. Este trabalho é fornecido com uma prova matemática da ausência de uma maneira mais simples de resolver esse problema - e este é um indicador de que os sistemas operacionais naturais provavelmente funcionam da mesma maneira.

Muito antes dos biólogos descobrirem como essas possibilidades eram realizadas na natureza, os engenheiros aprenderam a criar circuitos eletrônicos para sistemas de controle que manteriam a aeronave em andamento e manteriam uma operação estável de sistemas de refino de petróleo e outros processos automáticos. Os especialistas em teoria de controle chamam esse rastreamento de ponto fixo com erro zero no estado estacionário. Do ponto de vista matemático, o OOS pode corrigir o erro de três maneiras: proporcionalmente, de acordo com o tamanho absoluto do erro; integralmente, pelo tamanho dos erros acumulados durante a operação; diferencialmente, de acordo com a rapidez ou lentidão do erro. Os controladores eletrônicos de diferenciação proporcional integral (PID) combinam as três abordagens e são amplamente utilizados em sistemas de controle industrial.

De todos eles, é o sistema operacional integrado que fornece uma adaptação ideal estável; sistemas operacionais proporcionais e diferenciadores ajudam a eliminar distúrbios, mas não corrigem completamente os erros. Prova disso é "um antigo teorema da teoria do controle", disse John Doyle , matemático do Instituto de Tecnologia da Califórnia. Para entender como a natureza alcança uma adaptação ideal estável, era necessário que um especialista em teoria de controle percebesse uma conexão com um sistema operacional integrado.

OOS é um ótimo exemplo da incrível semelhança entre biologia e engenharia. Em 1948, o matemático Norbert Wiener propôs estudar juntos os sistemas reguladores de animais e máquinas, no campo da ciência, que ele chamou de cibernética , do grego “cybernetes”, “a arte do controle” (kybernḗtēs - steering).

"Matemática, engenharia (pelo menos moderna) e biologia têm uma coisa em comum - uma enorme complexidade oculta", disse Doyle. Tome, por exemplo, um telefone celular. Parece ser fácil de gerenciar, mas isso oculta muitas camadas de circuitos de controle construídas umas sobre as outras.

"A biologia funciona de maneira semelhante", disse ele. - Vivemos nossas vidas, aproveitando a complexidade de nossos corpos; e se não adoecermos, eles funcionam automaticamente e sem a participação da consciência. Nós mal notamos isso.

Como integrar vacas

Engenheiro eletricista em treinamento, Hammash pegou um livro de endocrinologia pela primeira vez na Universidade Estadual de Iowa no outono de 1998. Sua esposa, que acabara de dar à luz seu primeiro filho, desenvolveu tireoidite pós-parto e queria saber mais sobre sua doença. O texto do livro "poderia muito bem pertencer a um livro sobre teoria de controle, apenas sem equações", disse ele. "Esse hormônio faz isso, essa interação aumenta a quantidade disso, fecha o ciclo de feedback - a mesma história de uma nova maneira".


Mustafa Hammash, Professor de Teoria da Gestão e Biologia de Sistemas

Hammash ficou interessado neste tópico e foi para o outro lado do campus, para o centro nacional de doenças de animais. Lá, ele conheceu o fisiologista Jesse Goff, que sugeriu que Hammash estude a "febre do leite", uma doença de vacas leiteiras mais velhas associadas à deficiência de cálcio devido à produção de leite.

Os íons de cálcio controlam o trabalho de muitas funções do corpo, em particular a contração muscular e a transmissão de um impulso nervoso. Portanto, uma das variáveis ​​fisiológicas mais estritamente reguladas nos mamíferos é o nível de cálcio no sangue, variando de 8 a 10 miligramas por decilitro. A ordenha esgota o cálcio das vacas, levando a graves violações do seu nível sanguíneo, diz Hammash. Mas em uma vaca saudável, os níveis de cálcio no sangue são sempre restaurados.

"Como especialista em sistemas de controle, pensei imediatamente: deveria haver um integrador", disse ele. Portanto, a pergunta se transformou no seguinte: “Como as vacas se integram?”

Se o carro estiver dirigindo rápido demais ou o robô estiver muito próximo do objeto, o motorista poderá tirar o pé do acelerador e o robô poderá se afastar, reduzindo ou revertendo diretamente o que deu errado. Mas na biologia e na química, não há subtrações - a concentração de proteínas ou a taxa de reação não podem se tornar negativas. Mesmo que a célula pare a produção de proteínas, as moléculas existentes não irão a lugar algum. Em vez disso, tudo deve ser controlado pelo valor positivo das variáveis ​​- pelo equivalente do freio, que é o oposto do gás em efeito. Alguns mecanismos de integração matemática são necessários, calculando quanta pressão é aplicada ao freio e por quanto tempo.

Para responder a essa pergunta, Hammash contou com o apoio de sua aluna, Hana El Samad , agora liderando sua equipe de pesquisa na Universidade da Califórnia, em São Francisco. Eles rapidamente descartaram a possibilidade de o controlador integrado consistir em uma molécula; deveria haver pelo menos dois deles. Quando esse par de moléculas foi descoberto em 2002, descobriu -se que eles eram bem conhecidos pelos fisiologistas: é um hormônio da paratireóide e uma forma especial de vitamina D, calcitriol (ou 1,25-DHCC).

Quando o cálcio no sangue cai, a glândula paratireóide libera mais hormônio da paratireóide, que estimula os íons cálcio a deixar o esqueleto e corrige o erro proporcionalmente. Um aumento no nível do hormônio da paratireóide aumenta a produção de calcitriol no intestino, o que aumenta a absorção de cálcio no intestino delgado. Como a taxa de produção de calcitriol está ligada à concentração do hormônio da paratireóide, o mecanismo da OS é de natureza integral.

Hammash não foi o único cientista que percebeu que, para alcançar uma adaptação ideal estável, a natureza usa um sistema operacional integrado. Em 2000, Doyle mostrou matematicamente que a efetividade dos movimentos direcionados de bactérias em busca de alimentos é alcançada através do sistema operacional integrado. Mais tarde, El-Samad, Hammash e Doyle, como resultado de um trabalho conjunto, mostraram que a reação de choque das bactérias ao calor - sua produção de moléculas protetoras de chaperona durante o superaquecimento - é estável pelo mesmo motivo.

Instalação de integradores em células

Resolvendo o problema do cálcio, em 2002, Hammash e El Samad se mudaram para a Califórnia. Hammad não encontrou uma adaptação ideal estável até se mudar para Zurique em 2011 e não teve a oportunidade de estabelecer um laboratório de biologia sintética. Desta vez, sua tarefa era introduzir artificialmente o controlador nas células. Uma vez que esses controladores de células sintéticas podem ajudar os pacientes a recuperar o controle de processos regulatórios que pararam de funcionar normalmente, como, por exemplo, a produção de insulina em diabéticos.

A essa altura, os biólogos sintéticos já estão criando os contornos mais simples de proteção ambiental nas células, capazes de corrigir erros proporcionalmente. O primeiro exemplo, o contorno rudimentar em E. coli, apareceu em 2000 . Depois disso, El-Samad anunciou a introdução de um contorno proporcional da OS com proteínas sintéticas desenvolvidas em conjunto com a Universidade de Washington. Este trabalho foi importante porque El-Samad mostrou que proteínas modificadas podem ser usadas modularmente como periféricos PnP para computadores, como mouses ou impressoras.

Hammash decidiu aprender a programar um sistema operacional integrado nas células. "Qualquer controlador que se preze deve ter um integrador", disse ele, especialmente se ele quer ser estável.

No entanto, um sistema operacional integrado não é tão fácil de criar. "Precisamos fazer tudo da maneira mais correta possível", disse Doyle. Caso contrário, o controlador está desestabilizado. Em vez de se aproximar gradualmente do alvo, o controlador instável constantemente falha e começa a oscilar em torno do alvo.


Hana El-Samad, Professora de Bioquímica e Biofísica

A Hammash juntaram-se Gabriel Lilacci , um teórico que trabalhava no doutorado há um ano, e Stefanie Aoki , microbiologista pós-doutorado. A Trinity mudou-se para o edifício BSA-1058 no Biopark Rosenthal em Basileia e começou a equipar um novo laboratório no térreo. Nenhum deles possuía experiência no campo da biologia sintética.

O primeiro circuito que Aoki e Lilacci experimentou foi um circuito simples com um par de moléculas controladoras: na verdade, a proteína A, que inclui o gene da proteína B, e a proteína B, que desativa o gene da proteína A.

A ideia não deu certo. Foi um período desagradável para Aoki e Lilacci. "Não funciona como o esperado", disse Aoki. "Há um sentimento de que você não está no controle."

Parte do problema era que criar uma célula é muito difícil. Transferir conceitos bem conhecidos de sistemas elétricos e mecânicos para o campo da biologia é uma tarefa difícil, explicou Olsman. "Como pegar idéias que podem ser implementadas usando resistores e capacitores e implementá-las usando proteínas, RNA e DNA?"

E mesmo quando a Escherichia coli finalmente começou a mostrar sinais de que poderia corrigir os resultados dos distúrbios, verificou-se que, na verdade, era um artefato do experimento. "Deve ter sido um dos piores dias no laboratório", disse Lilacci.

Naquela época, os pesquisadores não entendiam isso, mas sua primeira opção estava incorreta em princípio. Do ponto de vista matemático, os organismos unicelulares são muito diferentes das grandes criaturas, como as vacas: eles estão sujeitos ao "ruído" estatístico. Relativamente poucas moléculas estão contidas em células individuais, explicou Hammash. O acidente decorrente da probabilidade de encontro, colisão e reação de várias moléculas dentro da célula desempenha um papel muito maior.

Ativadores e anti-ativadores

No oitavo andar do BSA-1058, dois teóricos da equipe Hammash , Korentin Briat e Ankit Gupta , começaram a discutir uma nova idéia no início de 2014. Eles perceberam que, para minimizar o efeito do ruído, duas moléculas controladoras devem ter uma conexão especial: devem estar conectadas umas às outras e neutralizar a atividade biológica uma da outra. Cada um deve ser a antítese do outro.

No trabalho, Briat, Gupta e Hammash descreveram um novo esquema. Nesse loop OOS, a molécula ativadora deveria estimular a produção da proteína desejada. A concentração dessa proteína, por sua vez, determinou a taxa de produção da molécula anti-ativadora que isolou o ativador. Se algo perturbasse o sistema, qualquer erro no nível da proteína seria corrigido por uma alteração correspondente na taxa de produção do anti-ativador. E o melhor: como as moléculas ativadoras e anti-ativadoras se procuram e se neutralizam, esse ciclo funcionará mesmo em uma célula barulhenta.

Gupta provou matematicamente que esse esquema forneceria um integrador estável para sistemas de células barulhentas. No entanto, tudo isso foram invenções puramente teóricas. A Trinity a projetou, sem saber como seriam as moléculas ativadoras e anti-ativadoras opostas - ou mesmo que tais moléculas existem. A falta de conhecimento de biologia se tornou um problema quando um especialista independente que avaliou o artigo pediu um exemplo específico.

Hammash escreveu um e-mail a um amigo, o biólogo Adam Arkin, da UC Berkeley, e pediu ajuda. Arkin rapidamente propôs o fator sigma e as proteínas fator anti-sigma, abundantes em bactérias. Arkin já os usou para criar uma troca artificial nas células.

No entanto, sigma e anti-sigma não eram as únicas possibilidades. Havia também RNA semântico e anti - sentido , várias toxinas e antitoxinas. "Existem montanhas de reações químicas adequadas para esta tarefa", disse Olsman.


Membros do Laboratório Hammash em Zurique

A teoria foi publicada em janeiro de 2016 e causou grande entusiasmo. "Agora está completamente claro como implementar essa integração", disse Olsman. Dois meses antes, Hammash pediu a Aoki e Lilacci que adiassem o desenvolvimento em que estavam trabalhando há três anos e tentassem criar esse controlador. "A base teórica para ele era muito mais sólida", disse Lilacci. Eles concordaram em tentar usar o mesmo par de fatores sigma e anti-sigma sugerido por Arkin.

Nada veio deles - pelo menos a princípio. Aoki e Lilacci tiveram que fazer algo com duas suposições básicas, que na realidade não foram cumpridas. Um por um, descobriu-se que o número de células não cresce e dilui os fatores envolvidos no processo. No entanto, eles cresceram e, no caso de E. coli, o número de células dobrou a cada 30 minutos. Segundo outro, descobriu-se que a taxa de expressão de proteínas pode ser ajustada dentro de quaisquer limites, mas, de fato, há um limite para isso.

No outono de 2017, enquanto seus colegas continuavam seus esforços no laboratório, Gupta foi a uma conferência em Ohio. Lá, ele se encontrou com outros pesquisadores tentando integrar integradores em células, de acordo com a teoria do controlador com antíteses. Todo mundo teve um problema. Gupta decidiu que poderia haver outro esquema mais simples de implementar que simplificasse a vida dos experimentadores.

"É aconselhável fazer perguntas sobre a existência de métodos mais simples", disse Lilacci. "E aconteceu que não havia tais métodos".

Gupta descobriu que as restrições matemáticas para uma adaptação ideal estável eram tão severas que limitavam as opções de circuitos que poderiam ser estáveis ​​em ambientes ruidosos. E todos eles precisavam de um par de moléculas opostas.

Hammash e Gupta aceitaram com satisfação a prova matemática de que sua abordagem, embora difícil, não era apenas confiável, mas inevitável. Aoki e Lilacci, que já haviam visto os primeiros sinais de que suas células poderiam começar a se adaptar às perturbações, essas notícias apenas surgiram.

"Descobrir que existe apenas uma topologia básica que pode alcançar esse resultado foi muito surpreendente para mim", disse Aoki.

Finalmente, Aoki e Lilacci criaram um conjunto de Escherichia coli capaz de manter a fluorescência estável, mesmo diante de distúrbios na forma de uma enzima introduzida que ingeria proteína de fluorescência verde. Uma coisa ainda mais interessante aconteceu em outro conjunto de células quando elas abaixaram a temperatura de incubação de 37 para 30 graus Celsius, mas a taxa de crescimento celular não mudou. As evidências e experimentos de Gupta de Aoki e Lilacci foram descritos em junho deste ano na revista Nature.

Olsman espera que este exemplo contribua para a penetração de abordagens mais racionais e matemáticas no campo da biologia sintética, faça com que seja mais engenharia. "Não estamos construindo mil aviões para erguê-los no céu e torcer para que não caiam", disse ele.

Além da adaptação ideal estável, há muitos outros fenômenos biológicos misteriosos que exigem decodificação - e Doyle espera que seja possível realizá-la usando a matemática.