O principal objetivo do uso de medicamentos que retardam o processo de envelhecimento é prolongar uma vida saudável e ativa. Este último, por sua vez, visa melhorar o bem-estar econômico da população em rápido envelhecimento do planeta. Para que qualquer intervenção farmacológica seja universalmente aprovada, os medicamentos devem ser eficazes em qualquer adulto e ter um bom perfil de segurança. Neste artigo, mostramos que, com a ajuda de medicamentos já conhecidos pela ciência, conseguimos aumentar significativamente a expectativa de vida de C. elegans. O aumento na vida dos vermes foi alcançado alterando a atividade de várias vias de sinalização evolutivamente conservadoras associadas ao envelhecimento. Devido à influência em diferentes vias de sinalização com um efeito sinérgico comum, esperamos poder desacelerar o processo de envelhecimento, dobrar a vida útil e também mais do que duplicar a duração de um período de vida saudável, sem alterações compensatórias no desenvolvimento e atividade física.
Até onde sabemos, a expectativa de vida dos nematóides de C. elegans alcançada em adultos com drogas foi a mais alta em nosso trabalho. Utilizamos medicamentos originalmente destinados ao tratamento de várias doenças de adultos. O desenvolvimento de um método baseado no uso de medicamentos já aprovados, atuando simultaneamente em várias vias de sinalização associadas ao envelhecimento, é considerado muito promissor. Pode levar à prevenção do desenvolvimento de doenças relacionadas à idade e astenia física da população idosa do mundo, que está envelhecendo rapidamente.
1. Introdução
Um dos estágios mais importantes da ciência do envelhecimento tem sido a descoberta de caminhos de sinalização evolutivo-conservadores responsáveis pela regulação da vida útil do corpo. Mutações nos genes que afetam essas vias de sinalização podem levar a uma extensão da expectativa de vida de 30 a 100% nos organismos modelo. Mutações genéticas combinadas podem causar um efeito sinérgico que aumenta a vida útil. O efeito das intervenções farmacológicas é geralmente muito mais fraco que o das mutações genéticas, mesmo que elas atuem nas mesmas vias de sinalização.
A presença de um efeito sinérgico com vários distúrbios genéticos combinados sugere que o uso de tais drogas que afetarão simultaneamente várias vias de sinalização conservadora evolutiva se tornará uma possível direção promissora no futuro. Até o momento, poucos dados foram registrados sobre o efeito sinérgico do uso de drogas, visando aumentar a expectativa de vida. Neste artigo, relatamos os resultados de um novo estudo in vivo no qual esses medicamentos foram usados. Demonstramos como uma combinação de medicamentos pode maximizar o efeito da terapia devido ao fato de eles agirem em várias vias de sinalização, com efeito mutuamente reforçador. Ao mesmo tempo, foi possível minimizar a frequência de reações adversas e o nível of de distúrbios compensatórios no desenvolvimento do corpo, uma vez que foram feitas alterações pontuais em vias de sinalização separadas, mas em interação. O objetivo final do estudo era desenvolver um regime farmacológico para a população adulta, com um efeito comprovado no processo de envelhecimento, igual ou superior ao efeito de mutações.
Como existem poucos marcadores biológicos geralmente reconhecidos para o envelhecimento, atualmente, para avaliar os resultados do estudo, eles simplesmente comparam a vida útil total dos organismos. Um nematóide da espécie Caenorhabditis elegans foi usado como um organismo modelo de vida curta. Em seguida, selecionamos várias combinações de medicamentos, de modo que foram criados 2 grupos de medicamentos, em cada um dos quais havia três. Como publicado anteriormente em estudos, ao usar essas combinações de medicamentos, houve uma diferença significativa no aumento da expectativa de vida e no prolongamento da vida saudável dos nematóides de C. elegans.
O efeito sinérgico obtido com a combinação de drogas mostrou-se comparável ao observado após mutações direcionadas nos genes conhecidos associados ao envelhecimento. Não revelamos distúrbios compensatórios no desenvolvimento de organismos daqueles freqüentemente encontrados e associados à intervenção farmacológica. Pudemos determinar indiretamente que a terapia medicamentosa diminuiu a taxa de envelhecimento natural, à medida que o nível de alguns marcadores aumentou. Além disso, concluímos que o TGFβ (fator de transformação do crescimento β1) foi um fator chave que proporcionou o efeito sinérgico da via de sinalização. Além disso, o estudo mostrou que, nos nemátodos tratados com as combinações de medicamentos acima, a proporção de lipídios monoinsaturados para poliinsaturados alterou o lado da prevalência dos primeiros (aumento da proporção de MUFA para PUFA) e o nível de peroxidação dos lipídios da membrana diminuiu. Finalmente, confirmamos que um efeito sinérgico semelhante também foi determinado em moscas da espécie Drosophila melanogaster.
Resultados
Escolha de vias e alvos de sinalização em C. Elegans.Com base na literatura científica moderna, encontramos várias vias de sinalização conservadora evolutiva e mecanismos relacionados ao envelhecimento (Material de Apoio, Tabela S1). Entre os alvos e mecanismos que selecionamos foram: proteína quinase ativada por AMP, quinase c-Jun-N-terminal (JNK), alvo de rapamicina em mamíferos (mTOR) e mecanismos envolvidos nos processos: restrição calórica (RC), mitogomesia (efeito de baixas doses de substâncias que em grandes doses são tóxicas) e metabolismo mitocondrial. Os objetivos e processos acima são considerados os principais na regulação de vias de sinalização que prolongam a vida. Para cada via de sinalização, foram determinados medicamentos cujo efeito na longevidade foi descrito em pelo menos um dos organismos modelo conhecidos (nematóides, moscas da fruta ou camundongos).
As pessoas que testaram drogas eram de particular interesse para nós. Portanto, preferimos compostos medicinais com eficácia declarada em mamíferos ou aprovados em humanos. Inicialmente, encontramos 11 medicamentos em potencial que atendiam aos critérios acima (tabela auxiliar S1). Adicionamos alantoína à nossa lista com base em um relatório sobre sua capacidade de prolongar a vida em C. elegans e os resultados da análise transcricional. Suspeitamos que seu mecanismo de ação seja diferente de outras substâncias. Para evitar erros na medição da expectativa de vida dos organismos após o uso de drogas, testamos primeiro o contratante usando o método cego. A principal razão para isso foi o fato de que os resultados do estudo podem depender muito da correção das condições experimentais e variar significativamente entre os diferentes laboratórios. Utilizamos apenas as doses de medicamentos descritas anteriormente em artigos científicos. A eficácia de cinco medicamentos que afetam a expectativa de vida foi repetidamente confirmada em nosso laboratório (Fig. 1, tabela de suporte S2). Como regra, em nosso estudo, a eficácia dos compostos associados a um aumento na vida dos organismos foi ligeiramente menor do que em trabalhos publicados anteriormente (Esquema Complementar 1, tabela de apoio S2).
Fig. 1Transcrição, medicamentos e longevidade
Para avaliar a eficácia dos fármacos no estudo, realizamos uma análise do transcriptoma e determinamos genes expressos diferencialmente (DEG) e enriquecemos as vias de sinalização em relação ao controle. Observamos certas diferenças na expressão gênica e na atividade da via de sinalização no grupo experimental, que não estavam no grupo controle. As alterações mais significativas na expressão gênica e nas vias de sinalização foram causadas pela ação de uma combinação de medicamentos composta por rifampicina, rapamicina e psora-4 (PSORA), onde o último medicamento foi administrado após os dois primeiros. Diferentemente dos medicamentos mencionados, a metformina (MET) e a alantoína (ALLAN) afetaram a expressão de menos genes (Esquema 2a, tabela de suporte S3).
A análise dos resultados da transcrição mostrou que cada substância do medicamento tinha seu próprio perfil exclusivo dos genes que foram alterados. Ao mesmo tempo, alguns desses genes também foram encontrados nos perfis transcricionais dos demais medicamentos (Esquema 2a). Assim, o MET atuou no trabalho de muitos genes "populares", mas o número de genes únicos envolvidos foi mínimo. As preparações MET e PSORA alteraram a atividade de quase todo o espectro de genes "populares", alguns dos quais também foram afetados individualmente pelos medicamentos mostrados no Esquema 2a.
O composto ALLAN afetou o menor número de genes, mas a maioria deles pertencia a um grupo único. Menos da metade de seus genes estava representada no espectro transcricional de outras drogas. O efeito do uso de RIF e RAP foi significativamente diferente um do outro e de quaisquer outros medicamentos. Com base nos três critérios da análise de componentes principais (PCA), concluímos que RIF, RAP e PSORA eram muito separados do restante dos medicamentos. Por outro lado, os efeitos de ALLAN e MET foram mais variáveis, mas muito semelhantes. Além disso, seus resultados foram um pouco próximos dos resultados do grupo controle.
Fig.2Na próxima etapa, determinamos como várias combinações de medicamentos afetam o tempo de vida dos nematóides. Como as ações do MET e do RAP são mais fáceis de transferir para os seres humanos, estudamos esses medicamentos em primeiro lugar. No entanto, verificou-se que a combinação de MET e RAP em doses ótimas de 50 mg e 100 mg não levou a um prolongamento da vida ainda mais prolongado (Esquema Complementar 2 J, P). Realizamos vários outros estudos usando todas as combinações possíveis desses medicamentos em doses ótimas e semi-ótimas (Esquema Adicional 2 JP).
O uso de MET e RAP em suas doses semi-ótimas resultou em um aumento na vida útil máxima dos nematoides (Esquema 2e, Esquema Adicional 2 m, s), mas não na expectativa de vida média (Esquema Adicional, 2p). Essa pequena vantagem do MET e do RAP é consistente com os achados de outro estudo em ratos. Provou que a adição de MET ao RAP prolongava principalmente a vida de homens e, em mulheres, o resultado era quase imperceptível (quando foi registrado).
Em seguida, descobrimos sequencialmente os efeitos de 10 combinações de medicamentos. Em cada combinação de medicamentos, havia dois dos cinco possíveis medicamentos (Esquema Complementar 2 ai). A análise do efeito sinérgico foi realizada usando o modelo HSA (modelo de atividade única mais alta), que estima o grau de atividade de um dos dois medicamentos.
O resultado do uso combinado de vários medicamentos foi considerado sinérgico, desde que excedesse em muito o resultado obtido pela ação de cada medicamento separadamente e quando as doses dos mesmos fossem iguais. Dada a definição acima, descobrimos que apenas duas em cada dez combinações de medicamentos tiveram efeito sinérgico (Esquema 2c, d, Esquema Suplementar 2 e Tabela de Apoio S2), corrigidas com uma combinação de medicamentos: RIF com RAP e RIF com PSORA. Três combinações diferentes de medicamentos poderiam ser feitas com esses medicamentos, mas apenas dois deles eram mais diferentes um do outro, de acordo com a análise da PCA. Foi nos dois últimos que um efeito sinérgico foi revelado (Esquema 2b, esquema adicional 4a, b).
Entre os 8 pares restantes de medicamentos, o efeito sobre a expectativa de vida em 4 foi o mesmo que para o medicamento mais eficaz na combinação correspondente. Em 4 outras combinações, o efeito de um medicamento excluiu mutuamente o efeito de outro. No último caso, também foram observadas a ausência de reações tóxicas e um aumento na vida útil (Esquema Adicional 2, tabela S2 de apoio).
Em nosso estudo, o uso de duas combinações de medicamentos com efeito sinérgico levou a um prolongamento da vida mais significativo, em comparação com dados publicados anteriormente na literatura científica. No entanto, o aumento da expectativa de vida após o uso de drogas foi menor que um efeito semelhante nos distúrbios mutacionais. Nesse sentido, temos perguntas: as taxas reais de sobrevivência são as máximas que podem ser alcançadas com o tratamento medicamentoso de animais adultos? Obteremos um aumento adicional na vida útil adicionando outros compostos? Se a combinação de drogas incluir três compostos de drogas, o número de combinações possíveis aumentará para 30. Não tivemos a oportunidade de verificar esse número de combinações de drogas.
Portanto, estudamos seletivamente o efeito de algumas combinações triplas de medicamentos. Primeiro, consideramos uma combinação de medicamentos em que todos os três compostos eram mais diferentes entre si com base nos critérios do método PCA. Outra condição foi a presença de um efeito sinérgico do medicamento quando utilizado em conjunto com outros medicamentos (RAP, RIF e PSORA). No entanto, a expectativa de vida do nematoide ao usar uma combinação dos três medicamentos foi pior do que quando se usa qualquer combinação dupla de medicamentos (Esquema Complementar 3a, tabela de suporte S2). Em seguida, testamos a eficácia da combinação tripla de medicamentos, que incluía o medicamento ALLAN com um perfil único dos genes envolvidos (arco laranja claro, esquema 2a).
O perfil de atividade dos genes ALLAN não coincide com o perfil dos genes ativos de outras drogas. Também diferia do espectro do transcriptoma mutante eat-2. Assim, levantamos a hipótese de que o composto ALLAN possui um mecanismo de ação único e, portanto, o adicionamos aos dois pares de combinações que mostraram um efeito sinérgico. Nos dois casos, observou-se um aumento estatisticamente significativo na expectativa média de vida e seu máximo (Esquema 2f, g, esquema adicional 3d-f e tabela auxiliar s2). O melhor resultado foi a combinação de três medicamentos: RAP, RIF e ALLAN, devido ao qual o tempo de vida médio dos vermes dobrou, e a mediana e o máximo atingiram 44 e 50 dias, respectivamente (tabela auxiliar s2). O efeito resultante foi comparável ao efeito de distúrbios mutacionais. Segundo nossas informações, essa extensão do tempo de vida de C. elegans acabou sendo a maior já publicada na literatura científica ao usar drogas usadas em adultos.
O mecanismo da sinergia de drogas
O Daf-16 / FOXO é um fator de transcrição que desempenha um papel fundamental na regulação da vida útil de organismos modelo e provavelmente também em humanos. Para estudar o mecanismo de ação sinérgica das combinações de drogas que identificamos, determinamos sua eficácia quando os vermes tinham uma mutação negativa na via de sinalização do Daf-16. O efeito de drogas como RAP ou ALLAN, tomadas separadamente, foi independente da via de sinalização Daf-16. Em comparação, a extensão da expectativa de vida usando o RIF deveu-se completamente ao trabalho da via Daf-16 e ao PSORA parcialmente (Esquema 3a, esquema adicional 8).
A combinação sinérgica de drogas RAP + RIF incluía uma droga RIF, cujo efeito era inteiramente dependente da via Daf-16, e outra droga RAP com um efeito independente dessa via de sinalização. Com o uso combinado de preparações RIF + PSORA, também foi registrado um efeito sinérgico, apesar do fato de a atividade dos medicamentos estar associada ao funcionamento da via Daf-16, e o nematóide ter um gene Daf-16 mutante (Esquema 3a, Esquema adicional 8).
Tais resultados foram inesperados, porque se constatou que o efeito sinérgico foi causado não apenas pela via Daf-16: esse efeito foi alcançado em mutantes dos worms do gene Daf-16 usando drogas cujas ações dependiam total ou parcialmente do funcionamento desse gene.
Fig.3De acordo com vários autores, vários dos medicamentos que testamos eram miméticos de RC (restrição calórica), isto é, substâncias medicinais semelhantes aos compostos sintetizados naturalmente no organismo, responsáveis por uma diminuição do apetite. Usamos os modelos mutantes eat-2 de C. elegans para descobrir se combinações de medicamentos e seus medicamentos sinérgicos influenciam as vias de sinalização de RC. Apenas o composto RIF prolongou a vida dos nematóides mutantes eat-2. Portanto, todos os outros, exceto os preparados RIF, pertenciam aos miméticos de RC.
, , RAP+RIF RIF+PSORA, CR , eat-2. RIF PSORA , ALLAN . , , ALLAN CR .
, . , , . , CR – , , eat-2 . , RIF CR – eat-2 ( 2h).
, , eat-2 ( 2h, 4 c, d). , TFGβ- ( 4a, 6, 7a, s4). , , , (. ). , TGFβ . ( s5).
eat-2 , . , eat-2 TGFβ eat-2 . , , TGFβ – ( 7b, S6). , ( 4b, 7a,c, s7).
.4TGFβ
TGFβ- , , , , . , TGF (daf-7) . daf-2 daf-7, daf-16- ( 7d). , , daf-2-, , . daf-2 .
RAP- : RAP+RIF RAP+RIF+ALLAN. , RAP . , , ( 3, 8, s2). PSORA daf-2- , , (RIF+PSORA RIF+PSORA+ALLAN) ( 3 8).
, , daf-7 . . , daf-7 , , , ( 3d, 8).
, MUFA
, age-1 daf-2 , . , TGFβ/daf-7 (TAG) , , daf-7 . , , , , TGFβ ( s3).
, , , , C.elegans SREBP-1c: sbp-1. , , -. (MUFA) ( 4, ). , -, . , TAG, MUFA:PUFA ( ) 16:1 19:1 (MUFAs)( 4f).
, (DBI)( ) (PI) ( 4i). PI , , . , , , .
, . , , , ( 5 e,f). , ( 4h). , .
.5C. elegans (ETC). , , ( 5i). , , : , . , , , . , ( 5-, 9).
, : , . , , , , (Herndon). 50% . , RIF+PSORA+ALLAN RAP+RIF+ALLAN, 57% 63% ( 5d, 9). , , .
, , – ( 5d, 9). , , , : RIF+PSORA+ALLAN RAP+RIF+ALLAN, , . , (18 ), , (7 ) ( 5g). , ( , 5e,f, 9b). , , , , , .
, , . , (MRDT ). Survcurv, . RIF+PSORA+ALLAN MRDT , (MRDT=3,7 3 , <0,0001, ).
(IMR) (IMR = 2.7e-3, IMR RIF+PSORA+ALLAN = 8.5e-4, RAP+RIF+ALLAN = 9.3e-4, P< 0,001). , , , .
Drosophila
. , , C.elegans, Drosophila melanogaster. , RAP , MET . . , , RAP ALLAN , RIF PSORA ( 6, s2).
, , RAP: RAP+RIF RAP+RIF+ALLAN ( 6). , PSORA: RIF+PSORA RIF+PSORA+ALLAN ( 6b). , RIF+PSORA , ( 6). Drosophila melanogaster , , - , , .
.6Neste trabalho, conseguimos encontrar várias combinações de medicamentos com efeito sinérgico. Eles influenciaram seletivamente certas vias de sinalização associadas ao envelhecimento e à longevidade. Além disso, os caminhos de sinalização podem se cruzar. Embora essas combinações de drogas fossem usadas apenas na idade adulta, a vida ativa de C.elegans dobrou. O tamanho do efeito das intervenções medicamentosas foi comparável ao efeito após mutações clássicas que retardam o envelhecimento. Até onde sabemos, este estudo se tornou o maior em termos de número e volume de intervenções medicamentosas em animais adultos.
Ao usar combinações medicinais sinérgicas que aumentam a vida útil dos vermes, não conseguimos detectar nenhum distúrbio compensatório negativo concomitante ou distúrbios no desenvolvimento do animal. Distúrbios semelhantes foram observados em organismos com mutações nos genes associados ao envelhecimento. Além disso, o efeito positivo observado da droga não se deveu a uma diminuição no trabalho da cadeia de membrana do transporte de elétrons (ETC) ou à inibição do metabolismo em vermes. A avaliação desses indicadores foi realizada com base no nível de consumo de oxigênio.
De fato, os animais que receberam combinações de medicamentos excederam o grupo controle de organismos em termos de atividade motora. Forma física e atividade foram as mesmas em indivíduos mais velhos no grupo experimental e em mais jovens no grupo controle (Esquema 5g). A análise da mortalidade mostrou que o efeito sinérgico das combinações de medicamentos diminui a taxa de envelhecimento biológico em cerca de 20% (Esquema Adicional 10). Para testar o efeito positivo do sinergismo medicamentoso e seu conservadorismo evolutivo, realizamos vários experimentos na mosca da fruta de Drosophila melanogaster. Duas das quatro combinações de medicamentos confirmaram a segurança de um efeito sinérgico.
Evolutivamente, nemátodos estão mais próximos dos mamíferos do que das moscas. Portanto, esses mecanismos conservadores e vias de sinalização em moscas e nematóides são antigos. Provavelmente, inicialmente o mecanismo de ação sinérgica existia no ancestral comum a essas três classes de animais.
Para estudar o mecanismo de ação da sinergia medicamentosa que prolonga a vida dos vermes, realizamos vários experimentos de epistasia (supressão de epistasia da ação de um par alélico de genes pelo genoma do par não alélico) e análise de transcriptoma. Como resultado, descobrimos que as vias de sinalização daf-2 / daf-16 (IGF / FOXO) e TGF (daf-7) desempenham um papel importante no funcionamento do efeito sinérgico (Esquema 4j). A relação entre esses dois caminhos também foi confirmada em outros estudos. Seus autores relatam que o daf-7 regulou a vida útil dos animais através da via de sinalização da insulina, e a via neural do TGF foi associada à ingestão de nutrientes e longevidade. Além disso, o daf-7 controlava o metabolismo de C. elegans e o processo de armazenamento de gordura. As mutações que prolongam a vida de C. elegans atuam no metabolismo lipídico dos vermes, aumentando a quantidade de lipídios monoinsaturados e diminuindo a quantidade de lipídios poliinsaturados.
Esses resultados são consistentes com os achados do nosso estudo. A sinergia das drogas aumentou o nível do principal fator de transcrição sbp-1, que afeta o metabolismo lipídico e a síntese de lipídios monoinsaturados (Esquema 4c, f, esquema adicional 5). A análise espectral de massa do lipidoma do nematoide, na qual foram utilizadas várias combinações de fármacos com efeito sinérgico, revelou alterações no metabolismo da gordura: ativação do fator sbp-1, acúmulo de triacilglicerol e aumento na proporção de lipídios mono e poliinsaturados na direção de um aumento no primeiro (incluindo em duas classes de lipídios - fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina). Finalmente, na literatura científica é descrito que a predominância de lipídios monoinsaturados sobre poliinsaturados é encontrada no perfil lipídico das membranas eritrocitárias de crianças cujos pais sobreviveram 90 anos ou mais.
Há um grande interesse entre os cientistas do mundo sobre a capacidade potencial do MET e, possivelmente, do composto RAP, de retardar o desenvolvimento de distúrbios relacionados à idade e prevenir doenças humanas. Dada a crescente atenção a esse problema, queremos mencionar experimentos em que a eficácia da combinação de preparações MET e RAP em C. elegans e camundongos foi fraca. Tais resultados decepcionaram muitos cientistas.
Em nosso trabalho, demonstramos que a expectativa de vida era determinada por um complexo de vias de sinalização e genes interagentes e moléculas bioquímicas. A influência simultânea de certas vias de sinalização em vários alvos pode levar a um efeito positivo perceptível e, às vezes, a um resultado imprevisível. Neste estudo, com base no princípio da evidência, usamos drogas que atuam nas principais vias de sinalização.
De repente, descobrimos um efeito sinérgico, de natureza universal e evolutivamente conservador. Os resultados do nosso trabalho confirmam a validade do uso de drogas que diminuem a atividade de muitas vias de sinalização conservadoras de uma só vez para diminuir a taxa de envelhecimento biológico. Se os cientistas conseguirem transferir esse princípio de ação para as pessoas, isso aumentará significativamente a eficácia dos cuidados médicos e o bem-estar econômico da sociedade.
Tradução: Tatyana Gneteeva.