John Lewis na conferência Undoing Aging 2018

A Oisin Biotechnologies é uma das muitas empresas que apareceram em nossa comunidade de apoiadores e pesquisadores relacionados à Methuselah Foundation e à SENS Research Foundation .

Os representantes da Oisin estão trabalhando em uma plataforma que pode destruir seletivamente células com base na expressão de proteínas específicas por essas células. Seus objetivos iniciais são células senescentes e células cancerígenas. Primeiro, eles levarão a terapia anticâncer para os ensaios clínicos, uma vez que tratamentos de câncer bem-sucedidos são mais fáceis de regular do que muitas outras terapias.

Isso permitirá que eles reutilizem a tecnologia, preparando-se para ensaios subsequentes de terapia senolítica , capazes de limpar muitas células senescentes de diferentes tecidos. Na conferência Undoing Aging , organizada pela SENS Research Foundation e Forever Healthy Foundation no início de 2018, o CSO da Oisin Biotechnologies, John Lewis, fala sobre sua tecnologia e novos resultados.

Desempenho

Boa noite a todos! É muito bom estar nesta reunião. Agradeço sinceramente a Aubrey de Gray e Michael Greve pelo convite. Eu não poderia nem pedir uma sequência melhor, porque o orador anterior fez um trabalho fantástico ao destacar as razões pelas quais as células senescentes são importantes e por que são um problema tão grande. Eu sou um cientista acadêmico de oncologia e um iniciante no campo do envelhecimento, embora tenha muita experiência em matar células, e gostaria de falar sobre isso agora: como a Oisin Biotechnologies desenvolve uma terapia muito seletiva para destruir células senescentes e câncer.

Não falarei muito sobre o que são células senenscentes ou o que elas fazem. Em poucas palavras, são células que surgem no corpo, como reação a estresses externos - estresse oxidativo , estresse genotóxico e inibem principalmente o desenvolvimento de câncer. Também é importante observar que, à medida que as células se tornam senescentes, elas também enviam sinais que se propagam no corpo . Repito que não temos marcadores universais de células senescentes. Existem características comuns que podemos usar em seu reconhecimento.

Por exemplo, o acúmulo de enzimas ativas nos lisossomos . Podemos manchar a β-galactosidase ativa. Mas, de fato, é uma população muito heterogênea, e elas surgem de maneiras diferentes. Não quero me deter nas conexões, apenas enfatizo que o início da conclusão do ciclo celular é governado por vários fatores: p16 , p21 , p53 . Nós pensamos sobre isso e perguntamos: quais são os caminhos comuns que podemos apontar para criar uma terapia direcionada que elimine essas células? Não preciso repetir que, embora as células senescentes estejam envolvidas no processo de envelhecimento, também existem doenças muito específicas que são sintomas do envelhecimento e que podem ser tratadas clinicamente com as mesmas técnicas.

Foi um ponto importante na última conversa que p16 pode não ser a história toda. Mas você precisa observar os dados que foram estudados nos últimos anos - e isso realmente me convenceu - de que, é claro, todas as células senescentes podem não expressar p16, mas no modelo do mouse é muito claro que, se você o projetar de tal maneira que você pode destruir seletivamente todas as células que expressam p16, obterá mudanças fenomenais no fenótipo. Para mim foi muito impressionante.

Por exemplo, o trabalho de John van Deyrsen , no qual havia camundongos geneticamente modificados expressando um gene suicida impulsionado pelo promotor p16, usando o chamado sistema INK-ATTAC caspase-9 , que lhes permite usar um dimerizador que ativa a apoptose nas células que expressam p16. E esses ratos mostraram mudanças fenomenais em seu fenótipo. Melhorias significativas na saúde, um aumento de 25% na expectativa de vida média, 50% menos câncer e alterações funcionais: uma diminuição na formação de catarata , uma diminuição na fraqueza e uma queda na queda de cabelo.

Vou mostrar, como introdução à minha palestra, alguns dados que foram recentemente divulgados. Eles me fizeram pensar que valeria a pena como terapia - este é o trabalho de Peter de Keyser , publicado no ano passado, usando os mecanismos p53 e FOXO4 . Ele foi capaz de usar um modelo de envelhecimento acelerado, os ratos que perdem cabelo ficam fracos e mostrou que a remoção de células senescentes após a ocorrência dessas alterações pode alterá-las. Isso para mim realmente confirmou o fato de que a destruição de células senescentes é o caminho certo para o desenvolvimento.

Portanto, este é o fundamento da tecnologia Oisin. Como grupo de engenharia, pensamos que, mesmo durante o desenvolvimento da terapia que podemos usar no tratamento de uma doença específica, pensamos no envelhecimento em geral e em como isso pode ser usado no futuro depois de verificarmos a eficácia clinicamente. Assim, queríamos usar uma estratégia semelhante, usando modelos animais modernos desenvolvidos em nosso tempo. Queríamos desenvolver algo que tivesse um perfil de baixa toxicidade bem tolerado e que pudesse ser repetido ciclicamente. Algo que não é imunogênico e não tem efeitos colaterais. Obviamente, muitos fenótipos de envelhecimento são específicos de tecido, e a capacidade de direcionar a terapia para diferentes tecidos seria uma vantagem.

O que vou contar hoje é a tecnologia Oisin que desenvolvemos. É chamada de plataforma SENSOlytic . Esta é uma plataforma de nanopartículas lipídicas (LNP) que contém um plasmídeo de DNA não integrável. Ele foi projetado para ser ativado por um dimerizador químico que inicia uma resposta apoptótica muito rápida e irreversível. Talvez a parte mais importante disso seja o sistema de administração de medicamentos - a capacidade de fornecer DNA plasmídico sistemicamente para diferentes tecidos sem toxicidade significativa. A Oisin desenvolveu uma tecnologia baseada em plasmídeos multiuso e, diferentemente do RNA de interferência ou do RNA mensageiro , os plasmídeos podem ser elegantemente projetados para serem ativados apenas quando uma via específica, como p16, p21 ou p53, é ativada. Mas eles também podem ser projetados com potenciadores ou repressores e têm como alvo tecidos ou doenças específicos. Criamos um sistema e uma biblioteca de projetos ativos em várias condições. Dois deles, que mostrarei hoje, são versões do promotor p16 e p53, incluindo genes suicidas.

Criamos uma biblioteca de plasmídeos, que são basicamente um promotor seletivo específico associado ao gene suicida induzido por iCas9, que é então incorporado ou dimerizado usando um dimerizador químico. Muitos de vocês já devem ter visto isso antes, mas o iCas9 é uma caspase modificada, por isso foi truncada, o domínio de inclusão foi removido e substituído pelo domínio de dimerização do FKBP . Essas áreas interagem fortemente com o dimerizador químico AP20187 ou seu análogo clínico AP1903, que é seguro, como foi mostrado durante os ensaios clínicos de fase II. O que é realmente bom nesse sistema é que você apenas expressa temporariamente os genes do plasmídeo em células com expressão ativa de p16 ou p53 no nosso caso. E nada acontece até você adicionar um dimerizador. O dimerizador de baixo peso molecular é muito bem tolerado, satura todos os tecidos em poucos minutos e causa uma resposta apoptótica irreversível. O iCas9 se dimeriza sob essas condições, se auto-cliva, ativa a formação de apoptossomas e causa a morte celular muito rápida em 2 a 3 horas. As células não podem resistir a isso. Eles não podem evoluir ou resistir a isso.

Alguns de nossos estudos in vitro usaram a linha celular de miofibroblasto placentário IMR-90. Nesse caso, induzimos senescência usando 10 graus de irradiação e células transfectadas usando iCas9. O iCas9 é um pouco menor que a caspase-9 e pode ser detectado com anticorpos para a caspase-9. Nas células que não foram irradiadas, não houve expressão de iCas9. Nos casos em que as células se tornam senescentes ao expressar p16, a indução de iCas9 começa e, quando adicionamos um pouco de dimerizador nessas células, ela desaparece. A cultura é rapidamente eliminada dessas células. Então, quando analisamos a capacidade de matar essas células, vemos em testes de viabilidade que todas as células que são transfectadas com sucesso com um plasmídeo morrem. Realizamos outros experimentos. Estou apenas mostrando um exemplo em que usamos citometria de fluxo e confirmamos que estamos causando apoptose nessas células.

Assim, temos um plasmídeo que é muito seletivo para células que expressam p16. Podemos matá-los muito rapidamente adicionando um dimerizador. A questão é como transformamos isso em uma terapia que funciona em humanos. Precisa de um mecanismo de entrega, muito eficiente e seguro. Decidimos usar nanopartículas lipídicas. As nanopartículas lipídicas são usadas há muitos anos, e eu diria que houve muitas promessas e investimentos e muito poucos sucessos. A Alnylam Pharmaceuticals em Boston recentemente conduziu um bem sucedido estudo de Fase III com uma preparação de mRNA, e o problema é que as nanopartículas lipídicas geralmente se acumulam no fígado e seu mecanismo de entrega de ácido nucleico às células usa uma carga positiva. Esta é uma tecnologia muito simples. Eles criaram lipídios com uma carga positiva. Se você usar uma carga positiva, eles furarão muito facilmente os orifícios nas membranas , e você poderá depositar material nas células com eficiência, exceto que elas são muito tóxicas. Assim, eles têm uma dose segura muito baixa.

Em resposta a isso, várias empresas desenvolveram o chamado lipídio condicionalmente catiônico . Esse lipídeo , geralmente neutro na corrente sanguínea, entra nos endossomos e se torna catiônico em um ambiente ácido. Eles são objeto de programas em andamento que passam por ensaios clínicos de nanopartículas lipídicas. Eles funcionam, mas ainda são muito tóxicos. Um sistema de entrega ideal é aquele que pode usar lipídios neutros com um mecanismo alternativo para a entrega celular de ácidos nucleicos. Vou lhe contar um pouco sobre como chegamos a ele. Se você possui uma nanopartícula lipídica e precisa entrar na célula, ela deve passar pela membrana plasmática com toda a sua proteção. Os vírus evoluíram ao longo de milhões de anos, resolvendo esse problema e desenvolveram muitas proteínas fusogênicas . Essas proteínas são lindas, gigantes e elegantes, e a maneira como conectam as membranas, criam poros e misturam lipídios é realmente fantástica, mas você não pode anexá-las a uma nanopartícula lipídica, porque são proteínas grandes com centros ativos gigantes e alta imunogenicidade.

Felizmente, existe um cientista canadense que estudou esses ortorrevírus fusogênicos por toda a vida e descobriu que eles não usam a proteína fusogênica para penetrar nas células, mas, assim que entram nas células, fazem com que todas as células ao seu redor se fundam rapidamente. Ele passou sua carreira caracterizando essa classe de proteínas transmembranares relacionadas à fusão, que são duas ordens de magnitude menores que a menor proteína fusogênica expressa por outros vírus, mas são suficientes para iniciar a fusão de células e, mais importante, de nanopartículas e células lipídicas.

Quando essas proteínas são incluídas em uma plataforma baseada em nanopartículas lipídicas neutras, você encontrará que lipídios neutros sozinhos são extremamente fracos na entrega da carga. Em nosso exemplo, usamos o plasmídeo mCherry contra células cancerígenas e, portanto, sem proteínas fusogênicas, não há entrega, e com elas obtemos uma entrega fantástica. Assim, eles aumentam a entrega de uma partícula lipídica neutra em 80-350 vezes e são bem tolerados in vivo . Em um experimento com luciferase, injetamos mRNA que expressa luciferase na veia da cauda. Temos expressão de luciferase em todo o corpo. Percebemos um acúmulo nos pulmões e no fígado, mas obtemos boa expressão em muitos tecidos, incluindo a pele e os tecidos moles do corpo.

Usamos nossa plataforma para fornecer carga útil contra células senescentes. A plataforma é chamada Fusogenix . Utiliza uma nanopartícula lipídica neutra, não tóxica e bem tolerada. E ela usa essas proteínas fusogênicas para entrar na célula. Eu não quero entrar em todas as pequenas coisas. Levamos três anos para criar anticorpos contra essas proteínas, elas são realmente não imunogênicas. A razão para isto é que a maioria deles são domínios transmembranares. Eles são lipofílicos , então eles embalam lipídios em torno de si e não são imunogênicos. Passamos muito tempo melhorando essas proteínas fusogênicas para torná-las melhores. Não vou me aprofundar em todas as pequenas coisas, mas agora temos uma plataforma para a produção industrial em grandes quantidades e liofilização , e podemos enviá-las mediante solicitação de uso.

Deixe-me mostrar os dados obtidos em um experimento - no qual eles pegaram a p16 caspase-9 ativada e a introduziram em ratos. Nesse caso, realizamos um experimento com 16 camundongos, um grupo de camundongos idosos de 80 semanas. Nós os dividimos em três grupos, nós apresentamos o LNP controle, sem um dimerizador, ou duas doses, 5 e 10 mg / kg - e 10 mg / kg - essa é uma dose grande. Tratamos esses animais uma vez por injeção na veia da cauda. Esperamos 96 horas e, em seguida, introduzimos um dimerizador, também por via intravenosa. Depois, esperamos mais dois dias, coletamos tecidos, sangue, realizamos RT-PCR sensível e controlamos com vários genes. Recebemos uma diminuição convincente dependente da dose na expressão de p16 em vários tecidos.

Vou mostrar algumas imagens nas quais passamos muito tempo otimizando a coloração de β-gal em ratos. Estas são as melhores imagens que temos, mas em vários tecidos recebemos uma diminuição dependente da dose na expressão da β-galactosidase. Informação muito encorajadora. Obviamente, trabalhar no laboratório é bom, mas se quisermos traduzi-lo em pessoas, há muitas coisas que precisam ser esclarecidas. A toxicologia é extremamente importante. Isso é importante para um medicamento que você está prestes a executar ciclicamente para garantir que seu corpo não forme anticorpos neutralizantes. Assim, realizamos muitos estudos sobre doses repetidas e não registramos nenhum anticorpo, para que possamos administrá-lo em doses repetidas sem diminuir a eficácia. O CARPA é algo que eu aprendi recentemente, uma pseudo-alergia ativada complementarmente , uma resposta imune que muitos pacientes que recebem terapia de nanopartículas, como o doxil, podem ter . Executamos todas as análises, e elas têm um perfil mais baixo que o doxil, portanto são muito bem toleradas.

Tenho o prazer de dizer que realizamos vários estudos piloto com primatas, administramos a eles uma dose humana máxima dez vezes maior e foi muito bem tolerada. Na verdade, esses macacos receberam tratamento, p53 e p16, separadamente e em combinação, e um dimerizador, por isso contamos com bons dados. Agora estamos trabalhando neles.

A tolerância dessas partículas é muito importante. Estou mostrando este slide porque mostra todos os esforços feitos nos ensaios clínicos de nanopartículas lipídicas e por que eles falharam. Se você observar os três primeiros programas, eles prometeram há dez anos usar lipossomas catiônicos e nanopartículas lipídicas. Você pode ver que a dose máxima tolerada é inferior a 1 mg / kg e todos esses programas falharam devido à toxicidade hepática. A segunda geração, lipídios condicionalmente catiônicos, foram transferidos em maior ou menor grau, e alguns desses programas foram bem-sucedidos e levarão à aprovação de medicamentos, mas todos os objetivos são o fígado. À medida que as nanopartículas lipídicas se acumulam no fígado, você verá uma toxicidade limitante da dose se não estiver usando uma composição lipídica neutra. Então você pode ver o trabalho usando uma composição lipídica neutra como a nossa, e eles não conseguiram encontrar a dose máxima tolerada em um estudo. Com base em nossos estudos de primatas não humanos, esperamos que nossas partículas sejam igualmente toleráveis.

Atualmente, estamos avaliando vários projetos para descobrir qual deles é melhor usado em seres humanos, e obviamente conversamos sobre isso nesta conferência - a criação de biomarcadores que são bons indicadores de ensaios clínicos, bem como em modelos animais para avaliar a eficácia. Nós realmente queremos conversar com qualquer cientista que tenha um bom biomarcador. Temos grupos de ratos nos quais analisamos a vida útil e a saúde desses ratos. Estamos pensando em mudar para a fase clínica quando obtivermos a análise de toxicidade de GMP e GLP .

Portanto, vou mudar para o câncer, porque é o nosso principal caminho para a clínica. Meu trabalho principal é estudar o câncer de próstata . Uma coisa que realmente me intrigou com a conexão entre envelhecimento e câncer é a ativação da via p53. O gene p53 é o gene mais mutado no câncer e existem muitos tipos de câncer que têm uma carga mutacional alta no p53. Eu tomo a próstata porque tem taxas baixas, em média elas compõem 10%, a maioria dos cânceres de próstata são de baixa mobilidade.Assim que você tiver uma doença metastática , essa taxa de mutação será superior a 50%. Portanto, é um bom objetivo no tratamento do câncer. Embora a proteína p53 em si ainda não tenha sido alvo de terapias contra o câncer, acredito que sejam muito promissoras. Na p53, você pode obter dois tipos de mutações. Durante a replicação ou mutação celular, eles ativam a p53 para reparar os danos ou sofrer apoptose. Portanto, as células sofrem mutação ou se livram da p53 para contorná-la. Como resultado, os caminhos de ativação reais são muito regulados. Então, essa ativação pode ser usada para matar células cancerígenas?

in vitro , , in vivo , . , . p53, iCas9, . . NOD/SCID . 500 ³ . , , . , 90-95% 48 – , , , , .

A prova real é a capacidade de fazer injeções sistêmicas e realizamos esses estudos. Este é apenas um exemplo de quatro ratos neste grupo. Crescemos esses tumores muito grandes, aumentando-os para um tamanho de 500 mm ³ . Nesse caso, fazemos quatro injeções diárias de LNP na veia da cauda e, no quinto dia, damos a eles uma dose do dimerizador sistemicamente. Mais uma vez, vimos resultados notáveis: uma redução do tumor de 50 a 98% em apenas dois dias. Isso levou a um aumento significativo na sobrevida após uma única injeção nesses animais. Em média, em seis ratos por grupo, os volumes tumorais são reduzidos em quase 70%.

Uma coisa que é muito importante: tumores primários não matam pacientes na maioria dos casos. Como é uma doença metastática, estamos muito interessados ​​em saber se podemos curar o câncer metastático. Obviamente, tomaremos esses casos nos primeiros ensaios clínicos. Assim, criamos vários modelos estudando a capacidade do LNP de controlar doenças metastáticas; nesse caso, temos um modelo de metástase sistêmica do câncer de próstata e um modelo de melanoma imunocompetente . Nos dois casos, no modo reutilizável, conseguimos controlar efetivamente essa doença.

Estamos no caminho certo. Claramente, o objetivo promissor de Oisin é desenvolver agentes que matam células senescentes. Mas tenho certeza de que, a curto prazo, é muito importante, não apenas para a tecnologia de nanopartículas, mas para toda a plataforma, mostrar sua segurança e eficácia na clínica. Portanto, já desenvolvemos ensaios clínicos da fase I / fase IIb para tratamento do câncer e agora estamos nos preparando para testar a toxicologia do GLP, o que facilitará esses estudos. Esperamos um IC por pessoa no início de 2019. Temos o prazer de acelerar o uso desta tecnologia. Mencionarei também uma coisa importante: existem muitos tipos de câncer nos quais ele pode funcionar. No Canadá, podemos realizar ensaios de fase I com todos os tipos de câncer, principalmente colorretal, próstata, pulmão e outros. Buscaremos o maior sucesso no tratamento e o câncer mais significativo,para poder expandir esse grupo e concluir a fase II.