细菌的基因工程：如何从细菌中获得我们需要的蛋白质

因此，在前两篇有关细菌基因工程的文章（ 一 两次 ）中，我们弄清楚了如何收集所需的基因，将其以何种形式引入细菌中以及如何精确地将其引入细菌中。 假设我们进行了所有这些操作，以便为生产蛋白质提供生物工厂。 现在，这只是小生意了-以最纯净的形式从细菌中获取我们的蛋白质。
解决此问题的方法有很多；大多数与色谱法有关。 阅读这些方法是如何工作的。

固定相“捕获”通过其（-OH）-基团的分子。

因此，我们得到了所需的菌株并增加了生物量。 现在，我们需要以某种方式从其中去除蛋白质。

首先，我们将培养物倒入离心瓶中。 细菌是相当大且很重的物体，因此，要使其沉淀，离心过程中不需要巨大的过载值：10000 g足以在20分钟之内。 结果，我们在瓶的底部得到了沉淀物，并形成了液体（称为上清液）。 我们倒出液体，因为我们的蛋白质存在于沉积物中的细菌中。 您可以根据情况进行进一步处理：立即处理所获得的沉淀物，或者冷冻并储存直至需要使用。 它可以存储很长时间。 处理污泥的其他步骤不取决于我们是否将其存储在冰箱中。

假设现在是处理沉积物的时候了。 接下来是什么？

首先，我们需要破坏细胞，使蛋白质得以释放。 为此，请使用以下方法：

• 顺序冻融。 它不是破坏细胞膜的最有效工具，但对蛋白质来说是安全的，因此通常从几个这样的循环开始，然后发展到更有效的方法。
  
• 超声处理（超声处理）。 该方法应用广泛，简单有效。 通常使用细长的“扬声器”将超声波直接传递到一定量的水中，该“扬声器”与细胞一起插入流体中，从而使“扬声器”的末端几乎到达底部。 这是一个非常困难的方法。 还有一个更柔和的选择-将超声注入管子漂浮在其中的水浴中。
  
  
  
  
  麻省理工学院的毕业生警告-仔细观察您的声音。
  
  在对细胞进行超声破坏时，重要的是监测温度：在超声的作用下，水会迅速升温，我们根本不需要使蛋白质变性，也不想将其煮沸。 因此，在第一种情况下（带有“细长柱”），将带有细胞的试管插入装有冰和水的杯子中，并且应该有很多冰。 在这种情况下，水充当冰和被冰冷却的试管之间的热界面。 在“软替代”的情况下，将冰直接添加到水浴中。
  
  
  演示“硬”超声处理。 请注意安装附近的可怕噪音，在此视频的2:06尤其令人耳目一新。 尽可能地节省了一些人：有人试图在声波处理期间离开房间，有人戴着特殊的吸音耳机。
  
  
  演示“软”超声处理。
  
• 将裂解剂添加到培养基中。 这些主要是洗涤剂，即“肥皂”（通常，英文中的“洗涤剂”一词意为“洗涤剂”）。 洗涤剂本质上与细胞膜中的脂质有关。 一旦进入细胞环境，清洁剂就会开始整合到膜中，从而导致其破坏。 我们只需要这个。 有时还添加溶菌酶-一种破坏细菌细胞壁的酶。
  
• 法国媒体。 细胞悬浮液通过入口阀被吸入工作缸，然后通过压力机从狭窄的狭槽中挤出。 当细胞通过间隙时，由于压力下降至大气压力而产生的横向力会导致细胞壁和细胞膜的破坏。

根据我自己的经验，我可以说与洗涤剂组合使用超声处理通常绰绰有余。

因此，我们得到了细胞裂解液-“汤”，由我们需要的蛋白质和大量的“垃圾”（染色体和质粒DNA，细胞壁碎片，各种蛋白质等）组成。 如何摆脱这一切？

必须回答的第一个问题是：“我们的蛋白质以什么形式存在于细胞中？” 有两个主要选项：

• 该蛋白质在裂解前是可溶的，并且很有可能在裂解后仍然存在，这意味着我们无法通过离心使其沉降。 但是，我们可以沉淀出裂解后剩下的大块“垃圾”：这样一来，我们将去除细胞壁，染色体DNA和其他大片段的碎片。 弃去沉淀物，并将上清液送去进行色谱分离。
  
• 细菌细胞质条件下的蛋白质不溶，形成所谓的 裂解后保留“包涵体”。 包涵体是蛋白质珠，如果蛋白质在合成过程中没有时间折叠（即呈其正常可溶形式），然后与另一种相似的非折叠蛋白质碰撞，就会形成蛋白质珠。 展开的蛋白质几乎总是具有疏水性斑块，在它们的帮助下它们彼此粘附。 在两只松鼠“粘在一起”之后，它们再也没有足够的自由度完成折叠。 然后第三，第四，第五游泳到他们身上。 结果，形成蛋白质颗粒。 通常当我们在细菌中合成真核蛋白时会发生这种情况（正如我之前写的，细菌无法折叠它们）。 结果，我们有大量具有“不良”空间结构的蛋白质。 但是每朵云都有一线希望，因为最终形成了颗粒，几乎完全由我们所需的蛋白质组成！
  
  由于在这种情况下我们的蛋白质是不溶的，因此在离心时，它与“垃圾”一起在沉淀物中。 我们丢弃上清液，然后将沉淀物中的尸体从所有不必要的东西中冲走，如下所示：
  
  1. 倒入1号洗涤缓冲液，其中溶解了“ 1号沉积物的垃圾成分”。
  2. 搅拌沉淀直至光滑，然后将其放在摇床上（摇动的设备）；
  3. 将上清液离心并倾倒。 结果，从沉淀物中分离出溶解在洗涤缓冲液No.1中的物质。
  4. 倒入2号洗涤缓冲液，其中溶解了“ 2号沉积物的垃圾成分”。
  5. 等等。 通常总共需要洗涤约5次。
  
  让我再次提醒您，如果我们正在处理包涵体，那么我们正在处理的是未折叠的蛋白质，这意味着它无法履行其中规定的功能。 因此，在随后的清洁之前，它会重新折叠，即变成活性形式。 最常见的重新折叠方法包括以下步骤：
  
  1. 在“非生理”状态下溶解身体。 通常，在双极性尿素的存在下，物体在高pH（约12）下溶解良好。 此方法的想法是，在中等pH值的介质中，质子很少，每个能摆脱它们的人都可以轻松地做到这一点。 质子带正电荷，这意味着所有质子供体都带负电荷，然后库仑定律做所有事情-带有大负电荷的蛋白质开始相互排斥。
     
  2. 从第一段开始，逐滴将“蛋白质溶液”的全部体积添加到缓冲液中主动混合的较大体积中，并保持适合蛋白质的条件。 这个阶段的想法是，在蛋白质浓度低的情况下，他在遇到未折叠的对手之前就很可能折叠。 通常，蛋白质溶液的液滴转移是在缓冲溶液体积中进行的，该体积超过溶液本身的体积至少10倍。

因此，我们已经准备好以折叠状态准备一些体积的蛋白质溶液。 对于任何“初始条件”，进一步的步骤都相同-我们通过孔径为100-450 nm的过滤器过滤溶液（以免堵塞色谱柱和色谱仪本身），然后进行色谱分离。

色谱类型

任何色谱法的原理是溶液的各种组分以不同的速度通过色谱柱，结果，“进入色谱柱入口”的组分在不同的时间流出。

但首先，让我们回顾另一种方法-凝胶中的蛋白质电泳。

这种方法可以根据蛋白质的质量分离蛋白质。 为此，将包含SDS和染料（通常是溴酚蓝）的缓冲液添加到样品中。 同时，缓冲液的密度高于水的密度，这样做是为了使样品和缓冲液的混合物更容易添加到凝胶孔中。 添加染料是为了控制将样品引入孔的过程，它还可以指示何时完成电泳：涂料的移动速度比蛋白质快，因此当到达凝胶末端时，电泳停止。 这非常方便，因为我们看不到蛋白质沿凝胶的运动。


SDS-PAGE电泳。 阅读和看一次比阅读一百次更好。 分子量标记应用于视频中预见性的第一个孔，研究的样本也应用于其余的孔。

SDS是关键成分：这种带负电荷的去污剂（表面活性剂）会使蛋白质变性，然后“包围”它们，结果证明，粘附在蛋白质上的SDS分子数量与蛋白质质量成正比。 然后根据库仑定律得出，在没有任何运动阻力的情况下，被SDS分子包围的所有蛋白质在电场中将具有相同的加速度（力随着电荷的增加而线性增长，但质量也随着电荷的增长而线性增长）。


带负电荷的去污剂SDS对蛋白质的作用方案。 首先，他谴责它，然后“包围”它。 结果，蛋白质位于带SDS的带负电荷的壳中，其SDS的电荷与蛋白质的质量成正比。

在这里，PAAG（PAAG-聚丙烯酰胺凝胶）为我们提供了帮助。 在聚合过程中，它形成直径近似相同的通道网络，小物体比小物体通过通道的移动快，大型物体的运动更快。 显然，重蛋白大于轻蛋白，因此轻蛋白运动更快。

电泳程序完成后，将凝胶染色。 更准确地说，蛋白质在凝胶中的位置会被染色-获得蓝色条纹（或黑色，取决于要涂的颜色）。 为了了解一个或另一个谱带对应的质量，您需要将其与某物进行比较，因此将所谓的凝胶应用于每种凝胶。 “分子量标记物”是具有已知质量的组分的混合物。


分子量标记条的例子。 此标记也很方便，因为它的两个条纹分别涂成红色：红色（70道尔顿）和绿色（10道尔顿）。 这有助于实验者在标记本身中导航。 1道尔顿是质量的原子单位，定义为处于基态的自由静止碳原子12的质量的1⁄12。

似乎是奇迹，而不是方法-条带不重叠，这意味着蛋白质被完美地分割了！ 但是实际上，科学家还没有学会如何在工业规模上进行蛋白质电泳，因此我们仍然使用柱色谱法。


任何色谱的近似方案。 圆柱是装满东西的圆柱体。 这种“东西”被称为“固定相”，而“流动相”是我们需要分离其组件的解决方案。 组件以不同的速度移动，因此分别离开色谱柱。

大多数色谱技术基于这样的事实：松鼠通过“以不同的热情”紧贴固定的色谱柱填充物而通过：那些“紧贴”并且移动得比每个人都慢得多的松鼠，而那些“不紧贴”任何东西的松鼠则迅速离开色谱柱。 结果，很大一部分混合物经常离开色谱柱而没有被“捕获”-它们在色谱分离的最开始就一起离开（这一部分称为“滑移”，因为它们滑过色谱柱而没有被“捕获”）。 但是，与那些“上钩”的人怎么办？

首先，让我们与那些“紧贴”的人一起弄清楚该列中发生了什么。 之所以会发生“钩子”，是因为固定相的表面上有东西能够“捕获”通过的蛋白质（一小会儿）有关这种现象的发生。 也就是说，“粘着”蛋白在与固相相关的状态下花费一些时间，然后脱离它（由于其自身的热运动，碰撞等），漂浮，再次与固相结合，再次断裂，依此类推直到他离开专栏。 显然，它与固定相结合的频率越高，越强，它沿色谱柱移动的速度就越慢。


色谱原理。 未绑定到色谱柱（载玻片）的物质会随流动相的速度（根据大小进行调整）移动。 绑定组件具有不同的速度，这导致它们在输出中分离。

一般来说，只有在混合物中运气不好的情况下，不同的组分才能以相同的速度运动，因此我们可以等到它们离开色谱柱。 但是随着组件的缓慢移动，通常会“等待很长一段时间”。 在这种情况下，需要“自定义”它们，“自定义”方式取决于列的类型。

最后，让我们检查适用于白色工业生产的色谱法本身。

1. 离子交换色谱。 该方法的思想是在色谱条件下固定相带电荷。 如果电荷为正，则他们谈论“阴离子交换层析”，如果电荷为负，则谈论“阳离子交换层析”。
   
   名称的逻辑很简单，让我们以阴离子交换剂为例进行考虑：混合物中带负电荷的成分“粘附”在色谱柱的带正电的固相上。 此外，如果我们在固相表面上跟随一个特定的带正电的基团，那么一个或另一个带负电的组分将“粘附”在其上并脱落。 因此，在固定相和流动相之间会发生一种阴离子交换，因此命名为“阴离子交换色谱”。
   
   显然，如果要使用阴离子交换色谱，则必须在固相带正电的条件下进行混合物的分离。 此外，根据事件在这种情况下蛋白质所带的电荷，我们可以选择两种方法来进一步发展事件：如果蛋白质为“-”，则它将“坐下”在色谱柱上；如果蛋白质为“ +”，则将在色谱柱上滑动。
   
   如何加快相关组件的输出，即如何进行“洗脱”？ 您可以通过两种方式采取行动：
   
   • 您可以通过改变流动相的pH值来改变固定相和键合组分的电荷。 逐步进行pH调节很重要，这样组分才能加速其运动，但不会一次全部“掉落”。
     
   • 向色谱柱中添加其他阴离子。 的确，该色谱柱有一定数量的阴离子可以附着的位置，如果我们用某种物质占据所有这些位置，则混合物的组分将移动得更快。 对于阴离子交换色谱，通常要添加氯阴离子。 竞争性阴离子的引入也应逐步进行。
   
   阳离子交换色谱的程序通常相同，只是相反。
   
   
   
   
   阳离子交换色谱，由于流动相pH的变化而洗脱。
   1-在pH = 2时，在流动相中有很多质子；因此，混合物中的所有组分都是从液体中拾取的，同时带有正电荷；
   2-在pH = 5时，流动相中的质子数减少，“紫色”组分不再充当受体，而是充当质子供体；因此，在此pH值下，电荷为负，它离开色谱柱。 “绿色”组分仍然充当质子受体，并且在给定的pH值下仍保持正电荷，这意味着它仍保留在色谱柱上。
   3-在pH = 9时，流动相中的质子很少，“绿色”组分也变为质子供体，获得负电荷，最后离开色谱柱。
   
   通常，离子交换剂类型和分离条件的选择取决于我们要分离的物质以及混合物中的其他物质。
   
2. 另一种分离方法是基于某些物质的疏水性（〜非极性）和亲水性（〜极性）。 这里的想法与离子交换器的情况完全相同：根据它们的物理特性，这些成分在疏水性和亲水性介质之间“冲动”，有些滞留更多，有些更少。
   
   首先，我提醒您，非极性溶解于非极性，极性溶解于极性。 通常，“疏水”和“非极性”与“亲水”和“极性”相同且相同，尽管在通常情况下并非如此。 乙醇是非极性溶剂的例子，水是极性的例子。
   
   
   
   
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那好 因此，我们分离了蛋白质，现在可以将其用于结构或功能研究，在科学实验室或环境分析中用作试剂，用于医疗目的或工业用途。