分子微马达速度分析用于HIV诊断



人类免疫缺陷病毒或简称HIV是20世纪的瘟疫。 标题很大,但并不夸张。 这种疾病夺走了数百万人的生命。 每年,这种隐性疾病的受害者人数都在增加,旨在治疗和诊断艾滋病毒的研究也越来越多。 在发展的早期阶段,最容易治疗的疾病是艾滋病,也不例外。 但这需要一种尽早识别出它的方法,甚至在开始出现最初症状之前也是如此。 例如,当您割伤手指时,您会看到割伤,即您清楚地知道该如何治疗。 艾滋病毒可以在人体中生活而不表现出来,即无症状地存在相当长的时间。 今天,我们将考虑可以通过连接到智能手机的小型设备快速,准确地确定免疫缺陷病毒的存在的新发明。 这种创新是如何工作的,其结果的准确性如何,研究人员未来的计划是什么? 我们将在研究小组的报告中寻找这些和其他问题的答案。

理论基础

谈论疾病是不愉快的,但是必要的。 我们对他们了解的越多,我们越能保护自己和亲人免受他们的影响。



HIV-人类免疫缺陷病毒最早在上世纪80年代初就表现出了可怕的鬼脸。 然后没人知道它是什么,病毒本身甚至都没有名字。 进一步的研究表明,HIV是一种逆转录病毒,可感染人体免疫系统中最重要的系统之一的细胞。 病毒的作用是抑制免疫防御和发展艾滋病-获得性免疫缺陷综合症。 在这种状态下,身体仍然无法防御,任何感染,甚至最轻微的感染(以及癌细胞)都可能对其造成巨大影响。 本质上,HIV破坏了我们的防御能力,面对感染的敌人从容地占领了身体。

艾滋病毒具有传播的接触机制。 接触血液,精液,母乳,预接种的液体或阴道分泌物可发生感染。 换句话说,无保护的性交,受感染的医疗器械,甚至纹身店中未受感染的针头都是传播病毒的好方法。 在HIV出现期间,当恐慌在人群中的传播速度快于有关HIV是什么及其传播方式的可靠信息时,人们认为感染可能来自一次简单的握手。 这是一个神话,因为该病毒不会通过与感染者的简单接触而传播。 但是,也可以选择这种感染方式,但是仅在被感染者和可能的感染者手上有开放伤口的情况下。 我并不是在说一些被认为是蚊子传播HIV的蚊子(蚊子会喝掉病人的血液,并且咬住一个健康的人会感染他)也是一个神话。


根据世界卫生组织(2017)的全球艾滋病毒流行率。

我不会详细描述该病毒及其在人体中发展的后果,因为我们将不讨论病毒本身作为一种新的诊断方法。 但值得注意的是,艾滋病毒是一种患者病毒,随着时间的推移会在感染者体内发生变异,这使其对各种遏制或治疗方法的抵抗力更强。 这是为什么必须尽早发现它的另一个原因。 病毒拥有的时间越长,病毒越强,被感染的人就越弱。

设备由什么组成?

参与这项研究的科学家说,像其他疾病一样,世界上早期诊断HIV的最严重问题和障碍之一是缺乏适当的条件:实验室,人员,医疗设施。 这就是为什么他们决定创建一种可以准确指示体内是否存在病毒的设备的原因。 可以使用便携式紧凑型设备(血糖仪)检查血糖水平很长时间,也就是说,不必去实验室等待几天的测试结果。 这样的设备的成本非常低,这也伴随它们的分发。

我们今天将要熟悉的设备可以简要描述如下:一种基于环路等温扩增(LAMP)和纳米马达(CALM)的HIV-1分子测定的移动分析仪。 现在,为了秩序。

纳米马达

纳米马达(也称为微马达)被称为微观分子装置,能够转换运动中的能量。 如果将它们放置在特定的化学溶液中,它们将开始沿着特定的路线独立移动,该路线可用于诊断,甚至可用于纳米技术设备的能源供应。


HIV检测仪的微电机形成方案。

微型马达是由聚苯乙烯制成的球体,其表面涂有Pt(铂)纳米颗粒,密度为1.04 g / cm。 此外,Au(金)纳米颗粒还用于修饰带有DNA探针的微电机(在上图中,它们以红色“触角”表示)。

TEM(透射电子显微镜)显示,用于微电机涂层的铂和金纳米颗粒为球形,直径为57.721±5.181 nm(Pt)和3.43±1.336 nm(Au)。


上面是TEM图像,装有纳米颗粒的光瓶以及光谱的结果。

有必要检查完全形成的微电机的DNA探针捕获DNA分子的效率。 为此,使用了琼脂糖* (C 12 H 18 O 9 )凝胶电泳技术。
琼脂糖*是由一系列通过1→4键连接的β-D-半乳糖吡喃糖残基和3,6-酸酐-α-L-半乳糖吡喃糖形成的线性多糖。 从琼脂获得。


这项技术使我们能够确认微电机的表面上有DNA探针,因为它们能够附着约180 bp的人工DNA分子(成对的碱基),这对于此类(人工)样品是极好的结果(左图)。 第一次测试中的捕获效率约为30%,这已通过荧光测定法得到了证实(左图)。


在这里,我们看到微电机如何在具有不同浓度的H 2 O 2 (0、5、10和15%)的溶液中运动。

还必须检查微电机的最重要特征-运动。 为此,使用了有和没有H 2 O 2的溶液(下图d中的轨迹比较)。 当没有过氧化氢时,由于布朗运动,微电机振动。 当开始向溶液中引入H 2 O 2时 ,溶液中每过1%的过氧化氢,微电机的速度提高约0.7μm/ s。


测试溶液中微电机速度的测量。

a显示了直径为6μm的微电机的速度与溶液中H 2 O 2浓度的关系。 同样(在右侧)是微电机及其轨迹的快照。 图b显示了微电机在5%过氧化氢溶液中各种温度下的稳定性程度。 在下面的图表和快照中,我们可以看到稳定性指标如何随时间(120 s)变化,以及在15%的解决方案中的运动轨迹。 曲线图e中显示了随时间变化的均方根位移:黑点-无H 2 O 2的溶液,红色-5%H 2 O 2

在下面的图像f中 ,我们不仅看到微电机所处的溶液状态会影响其行为,而且微电机本身(更确切地说是其结构)也会对其产生重大影响。 与直径为6μm的成熟微型电动机(红线)相比,我们看到了直径为3μm的未从铂和金上喷洒的微型电动机如何运动(蓝线)。 轨迹比较的右边是微电机的平均平方位移的比较(直径分别为3μm和6μm)。

行动装置

摩托罗拉XT1575(Android OS)用于可视化和跟踪微电机(即,监视诊断如何发生)。


设备的外观和详细信息。

该设备的重要组成部分是检查微电机运动所需的芯片。 它是由聚甲基丙烯酸甲酯(有机玻璃)制成的。 使用80μm的胶水将带有2毫米宽的激光切割“通道”的玻璃底座连接到其上。


芯片的外观及其尺寸。

从上面的图片可以看出,芯片不是设备的唯一组成部分。 蓝色可移动盒由3D打印机上的廉价材料制成。 在这种情况下,内部有一个白色LED,一个3.3 V电池,一个开关和便宜的光学透镜。 另外,如果有一个样品架,可以将它们放在镜头和手机的相机之间。

现在介绍软件组件。 该软件是使用OpenCV 3.1.0库在Android Studio中创建的。 据科学家称,该界面对用户而言已尽可能清晰和实用。


HIV测试仪界面。

将样品放在设备中后,程序会记录一个视频(30 fps,320x240像素),该视频显示了微电机的运动,计算了它们的运动速度,并在1分钟内给出了分析结果。

回路等温放大(LAMP)

微运动系统在识别HIV-1方面的效果如何? 这个问题的答案在于LAMP反应。 为了测试,制备了几个具有不同浓度的HIV-1 RNA(核糖核酸)的样品。 通过琼脂糖凝胶电泳评价扩增结果。


灯泡测试。

电泳结果显示大DNA扩增子的逐步形成(DNA序列,扩增结果)。 扩增子的数量与HIV-1 RNA的浓度成正比。

将微马达与HIV-1 RNA扩增子混合,使其可以进行杂交过程(在80°C的温度下)。 接下来,在5%的H 2 O 2溶液中测试所得的“混合物”。 当系统中存在HIV-1 RNA扩增子时,微马达的速度大大降低,降低了约95.26%。 即使在低浓度的扩增子下(约3.394±0.245 ng /μl),也观察到速率降低。


在没有HIV-1 RNA的情况下演示微电机的运动。


在存在HIV-1 RNA的情况下演示微电机的运动。

科学家还设法恢复了微电机及其速度。 为此,将带有微型马达和扩增子的“感染”样品在90°C的温度下孵育30秒。 这使得从微马达DNA探针中释放扩增子成为可能。 随后以6000×g离心5分钟。 在5%的H 2 O 2溶液中对获得的样品进行验证,结果表明,在进行HIV-1 RNA扩增子参与测试之前,微电机的速度已恢复到原始速度的75.52%。

还测试了系统对其他类型的性传播病毒的反应:丙型和乙型肝炎,疱疹,乳头瘤病毒16(HPV-16)。 由于经常同时感染艾滋病毒和某些上述病毒,因此该检测也非常重要。 结果令人满意-DNA扩增子仅在HIV存在下形成。 也就是说,测试样本中其他病毒的存在并不影响检查过程。

结论很简单-该方法能够确定HIV的存在。 但是现在有必要进行校准,以使系统能够区分样品中是否存在病毒,重点是1000颗粒/ ml的标准浓度。 如果浓度低于此指标,则结果为阴性(没有病毒),如果浓度较高,则为阳性。 为了进行校准,必须确定微电机的什么速度对应于什么浓度。 为此,使用了PBS-磷酸钠缓冲液(一种特殊的研究溶液)以及有或没有HIV患者的血浆。

使用PBS进行校准,其中合成的稳定化HIV-1 RNA的浓度范围为0至107。

校准后,很明显,HIV浓度为1000时的平均微电机速度为0.705±0.082μm/ s。


确定HIV-1 RNA浓度的结果。

科学家们还使用ROC曲线对系统进行了分析,结果显示出令人鼓舞的结果。 被测系统的灵敏度*约为94.6%, CI *为 81.8–99.3%, 特异性*为 99.1%,CI为80.5–100%。
灵敏度* -反映阳性结果份额的指标(在这种情况下,这是样本中HIV浓度高于1000的概率)。

特异性*是反映阴性结果比例的指标(在这种情况下,这是样本中HIV浓度低于1000的概率)。

DI * -置信区间,即以给定的可靠性覆盖未知参数的区间。
系统结果的散点图也显示了令人难以置信的结果。 因此,确定HIV高浓度的阳性样品的准确度为100%,阴性样品的准确度为90%。

录像资料:

一段视频,显示当HIV-1 RNA浓度高于阈值时(正样本)微电机如何运动。


一段视频,显示当HIV-1 RNA的浓度低于阈值(阴性样本)时微电机如何运动。


那些希望更详细地了解这项研究的人可以研究科学家报告其他材料

结语

创造了这种惊人设备的科学家们并不否认他们尚未进行许多测试,校准和改进。 但是他们显然在正确的轨道上。 这样的设备可以大大减少艾滋病毒的传播,尤其是在那些根本没有配备人员和大量医疗设备的实验室的地方。

是的,该设备看起来还不太紧凑,需要使用智能手机这一事实会把某人推开。 但是,在将来,这种用于HIV早期诊断的技术将不仅在效率和准确性方面,而且在便利性和可负担性方面都将继续得到改善。

正如我在本故事开始时所写的那样,艾滋病毒是20世纪的瘟疫。 但是,不幸的是,这种病毒与“二十一世纪的瘟疫”的标题相距不远。 如今,几种疾病已经拥有如此响亮的称号(例如,抑郁症,糖尿病等)。 这些疾病都需要引起高度重视。 尽管没有可以治疗任何疾病的神奇药丸,但我们只能改善可用的诊断方法,这给了我们额外的时间来寻找治疗方法或控制疾病。 正如他们所说,我们越早知道一个问题,就越有解决这个问题的机会。

另一个重要点是社交活动,开放性和讨论性。 应该讨论这个问题,因为即使谈论这个问题很可怕,社会也打算如何应对呢?

无论如何,这就是我的全部。 照顾好自己和亲人。

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Source: https://habr.com/ru/post/zh-CN429594/


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