在任何一家医院的哪个办公室，有时都有儿童甚至成年人尖叫？ 与蚊子叮咬相比，有哪些父母在童年时期大胆地欺骗我们？ 我想您已经猜到这是验血。 现在，此过程变得更快且痛苦更少。 一件事没有改变-它的重要性。 在与疾病作斗争的早期阶段，医学诊断起着最重要的作用。 的确，为了战胜疾病，必须首先发现它。 在通过血液采样程序进行分析之后，您已经平静下来，等待其结果。 此时，在实验室中，使用复杂，笨重且非常昂贵的设备的人们会分析您的血液，以了解血液中的成分和数量。 在您当地的医院里建立这样的实验室是件好事，但并非总是如此。 但是，如果有一个袖珍实验室，它既小又便宜，但同时又能以与普通实验室相同的准确性和效率分析样品呢？ 听起来像科幻小说，对不对？ 当时的“口袋式血糖分析仪”这个词听起来也很有前途。 今天，我们将通过一种新型的紧凑型设备来了解蛋白质和氨基酸定量分析技术的研究和实现。 这个奇迹由什么组成，如何运作以及如何有效？ 在科学家的报告中，我们将回答这些问题和其他问题。 走吧
学习基础
我们生活在数字技术时代，数字技术正在我们生活的各个领域中得到成功实施。 实验室研究（诊断）也不例外。 科学家注意到，数字滴注分析的精度是传统方法的1000倍，并且可以在一滴样品中以飞升（fl，1 fl = 10
-15 L）为单位，在数滴样品中并行进行数百万次分析。
使用数字分析对检测核酸和蛋白质，分析单个细胞甚至外泌体非常有用。
外泌体* -细胞外囊泡（直径：30-100 nm），被细胞分泌到细胞间空间。 外来体参与免疫，蛋白质分泌等工作。
目前，最著名的数字分析方法是dELISA（数字酶免疫测定/ IFA）和qPCR（数字聚合酶链反应）。 这些技术使您可以处理单个单元格，同时获得不需要校正的非常准确的结果。 因此，最近，使用这些方法，成功地同时对一个细胞中的蛋白质和mRNA进行了定量分析。
类似的技术和他们的才华再次证明，在极小的环境（样本）中实施并行分析是完全可能的。 但是，像其他任何技术一样，这些方法也有缺点。 它们非常琐碎-尺寸，价格和制造复杂性。 研究人员提醒我们，一个数字放大器的安装（Quanterix的Simoa）的成本约为100,000美元。 并不是每个私人诊所都能负担得起这么多钱，我已经对国有医院保持沉默。
当然，夸张的“野兽” Quanterix的Simoa非常强大。 它使用带有微单元的平板电脑，每个单元有200,000个40 fl的单元。
Quanterix的Simoa同时，该设备最多可并行处理4片ELISA片剂，每片96个细胞。 因此，一台设备能够在一小时内产生66个样本的结果，每个样本都可以进行10重分析（即，同时分析1个样本的10个指标）。 这些数字确实令人难以置信。 但是，再次出现了这样的奇迹机器的价格和尺寸的问题。
图片编号1在这里，科学家建议将目光转向微流体液滴系统。 这类经典系统不能拥有Quanterix的Simoa出色的性能，但是它们可以作为新设备的基础。 理论上，连续流微流体液滴技术可以分析多达一百万个细胞。 但是，实际上，由于多种原因尚未实现这样的指标。 首先，当墨滴顺序（不是并行）生成并单分散时，吞吐量（每秒少于104个墨滴）。 其次，通过使每个液滴一次通过激光光斑来检测每个液滴的荧光。 换句话说，所有事情都是一致的，一次一次。 此过程显示在图像
1a中 （分离，温育和测定； 3小时分析10
7滴）。
将这种方法转换为紧凑格式的主要问题是难以并行化用于荧光多色检测的光学器件，集成样品制备过程的复杂性以及需要用于生成严格控制的液滴流的某些工具。 但是，无论他们多么令人印象深刻，科学家们都不习惯在遇到困难时放弃。
微型百万磅级探测器（MD，宏探测器）是当今我们英雄的创造。 该设备不仅可以在任何移动（口袋）设备中实现，还可以满足普通大型实验室的定量分析标准。 该过程显示在图像
1b中 （分离，孵育和测定； 10分钟分析10
7滴）。
为了实现这一目标，研究人员表示，执行了三个主要任务：
- 代替每次产生1个液滴，而是并行产生微流体液滴，工作速度提高了100倍。 科学家在单分散液滴生产领域的成就（ 链接到本研究 ）使得摆脱液滴单分散性对流速的依赖性成为可能。 这允许使用可以集成到移动（手持）设备中的非常便宜的蠕动泵。
- 借助基于手机的可视化功能，可以以超过每秒105的速度（请记住我上面提到的104的极限）快速读取液滴荧光，这比传统读取（依次读取液滴）快100倍。 在这种情况下，不需要昂贵的光学器件，并且在手持移动设备中的实现是显而易见的。 这项创新的主要特色是能够克服数字图像低帧速率的限制，并通过使用独特的非周期性信号调制不同颜色的LED或激光二极管的多个激发源来提供多色荧光检测。 可以对视频进行解码以获得液滴荧光数据，从而克服相机帧频限制。 因此，有可能达到每秒一百万滴的极小值（前面提到）。
- 最后，集成了微颗粒处理单元（或微珠，微观球形物体），液滴产生器，用于液滴孵育的信号延迟线和荧光检测器。 总之，这提供了一种廉价，紧凑且有效的设备，用于输入未处理的血清（样品）和输出分子数据（结果）。
为了证明他们的发明，科学家使用从荧光染料获得的不同颜色的微粒实现了多重DIGA。 每种颜色是微珠抗体所针对的蛋白质的颜色“代码”（
1c ）。
当滴剂含有带有荧光红色免疫复合物的微颗粒时，使用紫外线和绿色荧光颗粒对血清中的血清GM-CSF和IL6进行多重分析。 牛血清用作定量分析的介质，测定极限为0.004 pg / ml（皮克每毫升，1 pg = 10
-12 g）。 这是标准ELISA的1000倍，并且与数字ELISA的准确度相对应。
处理一千万滴只需十分钟。 在这种情况下，过程本身包括液滴的产生和孵育，以及每个样品的荧光滴检测。
设备结构与分析过程
图像＃2：MD设备结构。有关上图的更多信息：
2a-芯片图，俯视图和仰视图；
图2b是MD芯片的照片，其中所有的光通道均可见。
图2c是将微珠封装成直径为40μm的液滴的过程的显微照片；
图2d是延迟线之后的液滴的荧光显微照片。
图2e是MD平台（移动电话，3个光源和MD芯片本身）的示意图。
MD的主要成分可以称为微颗粒处理器，后者从血清中捕获目标蛋白。 之后，将颗粒用免疫复合物标记，以在液滴内部进行后续扩增。 在每个这样的过程之间，都会进行反复（多次）清洁。 还存在液滴产生器，其中将微粒与酶底物混合并封装在水油液滴中。
接下来是微流体通道，液滴通过该通道持续3.2分钟。 该通道是该过程的延迟/减速所必需的，其允许酶促扩增荧光信号。 最后一部分是基于手机（相机）的检测器（或扫描仪），在其中检测液滴的荧光。
微颗粒处理器由用于固定颗粒的半透膜组成。 将几种试剂和洗涤缓冲液递送至固定的颗粒。 此后，将颗粒释放出来以进行进一步分析。
膜本身由聚碳酸酯制成。 在膜上蚀刻具有直径为3μm的孔的300mm
2的蚀刻轨道。
在该实验中，有两组微粒：（d = 5.4μm，ex / em = 470/490 nm，CFH-5052-2），用抗GM-CSF抗体（MAB2172）和（d = 4.5 μm，ex / em = 370/410 nm，CFP-4041-2）用抗IL6抗体（MAB206）功能化。
首先，微粒与样品一起经历孵育过程1小时，然后才被捕获到上述膜上。
在这一阶段（在膜内），将颗粒用1 ml T20缓冲液以10 ml / h的流速洗涤，与0.1 ml 0.7nM检测抗体在T20缓冲液中孵育0.5小时，再次在1 ml T20缓冲液中洗涤以10毫升/小时的速度，然后通过将流速更改为6毫升/小时将其从膜中释放出来。
之后，将释放的微珠与ELISA底物混合，并封装在直径为40μm的液滴中。 为了确保颗粒和底物的准确混合并最大程度地减少来自产生荧光信号的酶的背景信号，使用了长度为14 mm的特殊通道。
液滴发生器的设计应使液滴直径与流速无关。 该设备仅具有这些发生器中的100个，在输出时每秒产生100,000滴的吞吐量。
每滴都封装有1个颗粒，或者保持不变。 同时达到一定浓度-比微粒多10滴（例如20滴-含颗粒10滴，不含颗粒10滴）。 这降低了在一滴中会出现多达0.5％的两个颗粒的可能性。
在液滴生成器之后，有一条类似于螺旋的延迟线，其通道宽度为1.8毫米，高度为1.5毫米。 延迟线应该足够长，但是您不能增加设备的尺寸。 因此，将四个螺旋一对一地制成，以使其完全通过，以67 ml / h的流速，液滴将需要3.2分钟。
为了将此类设备引入移动平台，必须解决与手机摄像头有关的某些任务。 通常的时间常数光激发的使用导致这样的事实，即在照相机的视场中移动的液滴被可视化为条纹。 该条的长度设置了液滴之间的最小距离，因此严重限制了生产量。
如果我们使用伪随机序列（及时）激发光，这将使我们能够“看到”单个液滴。 光的调制速度是相机曝光时间的10倍。 由于这种差异，液滴会形成条带，它们之间的距离（三个液滴直径）足以对其进行单独确定。 在这种情况下，您可以跳过相机前面的120个平行滴注通道。
检测和扫描的另一个重要点是荧光。 为了进行多重ELISA，需要几个不同的荧光信号，为此，一次要使用3个光源，每个光源具有激发某种荧光染料所需的波长。 这个三重系统由两个二极管激光器（蓝色，绿色）和一个LED（UV）组成。
图片编号3：“采样结果”过程（解码手机相机中的数据）。为了准确解码来自手机相机的视频，有必要对与三个光源分别对应的三个预期调制模式（
m ）进行相关检测。
结果是相关矢量（
3a ），其中：
k-帧；
n = 1：设备中的120个通道； 数码相机的
R ，
G ，
B色通道；
r ，
g ，
b色激发。
通过最大长度序列（MLS）| m |创建液滴模式。 = 63位。 此外，在数字图像中每个位是10个像素，也就是说，总共63个位是630个像素（1920年帧宽的1/3）。
为了确定液滴是否包含微颗粒，必须进行荧光扫描，如果有的话，以确定颜色（UV或绿色-蛋白，红色-目标分子）。 收到此数据后，必须将其提取。 为此，根据相机的传感器（
3d ）将视频帧分为红色，绿色和蓝色部分。
该设备使用了云技术。 这样做是为了减轻熨斗（即电话本身）的负担。 代替控制液滴的速度或相位，而是执行云计算来确定具有未知的相位或速度（
3s ）的液滴。 在确定最佳相位和液滴速度之后，可以精确地确定相关空间
Ψr，g，b k，n （x，
u c ，θc）（
3f和
3g ）的峰值。
收集的数据将上传到一个特殊的应用程序（到目前为止，仅在Android OS上），该应用程序会将它们发送到云中，以使用远程服务器上的MATLAB进行处理。 之后，已处理的数据将返回至智能手机并显示在屏幕上。
经过所有准备和测试工作，科学家们决定在其创作和现有的商用全尺寸设备Simoa的参与下进行一次“散布”。
在测试对决中，使用了三种版本的工作介质：PBS-磷酸钠缓冲液，FBS-胎牛血清和人血清。 最重要的指标是检测限（LOD），即样品中分析物的最小含量。
MD芯片测试结果。
通过测量104至102 pg / ml的系列稀释液，在PBS培养基中进行了M-CSF（图
A ）和IL6（图
B ）的几次单重测量。 在该测试中，获得了非常好的检测限：GM-CSF的LOD = 0.0045 pg / ml，IL6的LOD = 0.0070 pg / ml。
在FBS溶液中（1：4）也进行了类似的测量。 在这一阶段，用于分析的样品被分为研究设备和商业“重量级” Simoa一半。 结果，科学家的创造显示出极佳的结果，实际上并不逊于Simoa的结果（R2 = 0.95，上图
C ）。
但这是单重分析，即对一个指标的分析。 现在，有必要检查MD芯片将如何应对几种蛋白质的平行分析，即同时进行GM-CSF和IL6的双重分析。 首先，将一定量的GM-CSF添加到FBS中，并且IL6的浓度为零（图像
F和
G ）。 然后进行相反的操作：GM-CSF的浓度为零，IL6浓度为零。
在这两种情况下，检出限与之前进行的单重分析的结果相差无几（对于GM-CSF，p> 0.88；对于IL6，p> 0.90）。
之后，将一定量的GM-CSF和IL6（图像h）添加到样品中。 检测精度非常好-GM-CSF的R2> 0：99，IL6的R2> 0:99。
最重要的测试是对人血清的分析。 血样取自14名受试者。 研究人员使用MD和Simoa芯片对这些样品的GM-CSF和IL6进行了定量。
使用MD和Simoa对人血清GM-CSF和IL6的定量结果。结果表明，使用MD芯片进行的分析结果与Simoa（R2 = 0：96）的结果非常接近，后者是目前最准确的分析仪。
演示设备。要更详细地了解研究的细微差别和细节，我建议您
研究研究组的
报告及其
补充材料 。
结语
速度在医学中起着巨大的作用。 进行准确诊断的速度越快，您开始治疗的速度就越快。 有时甚至不算几天，但几分钟是不会浪费的。
但是，当您根本没有诊断工具时，时间并不总是主要因素。尺寸，某些产品的复杂性和某些精确分析设备的价格，以及配备了一切必需品的实验室设备，都无处不在，而且相距甚远。创建像MD芯片这样的设备不仅是一个好主意，而且是一个绝妙的，非常重要的主意。廉价的分析仪同时显示出卓越的准确性和工作速度，可以极大地影响全世界的药物，尤其是在无法使用标准工具的地区。据科学家们自己说，这种设备的原型成本约为500美元。在批量生产中，消费者的价格仅为5。人人有权获得治疗，但是由于许多原因，这项权利远非总是如此，并非在任何地方都可以与现实相提并论。类似的研究和类似的设备将有助于改变这一状况。谢谢大家的关注，保持好奇心，祝您工作愉快。感谢您与我们在一起。 你喜欢我们的文章吗？ 想看更多有趣的资料吗？ 通过下订单或将其推荐给您的朋友来支持我们，
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