为善而害：Lamprey的免疫系统与人类脑癌作斗争

我们的大脑是我们的一切。 违反这一重要器官的工作规定，将导致可怕的后果，有时甚至是致命的后果。 大脑及其神经组织的复杂性是巨大的，这极大地增加了治疗特定疾病的过程。 通常，当我们治疗某些东西时，我们试图摆脱疾病引起的缺陷。 但是，如果使用这些缺陷来对抗造成这些缺陷的原因怎么办？ 这正是我们今天正在考虑的研究的作者决定要做的。 科学家如何应用血脑屏障的破坏作用，为什么我们需要进入大脑的细胞外基质，七lamp鳗寄生在鱼类上的作用是什么？ 研究小组的报告将告诉我们这一点。 走吧

一点理论

首先，值得整理一下该实验剧中的角色。


血脑屏障

血脑屏障（BBB）是中枢神经系统（CNS）与循环系统之间的生理屏障，是其中的主要角色。 这种屏障可防止神经组织与循环血液的各种成分接触，其中可能包括免疫系统的毒素，微生物，细胞/体液因子，这些因子可对脑细胞产生异物反应。 可以将BBB与一个非常昂贵的俱乐部中的蹦床相比，它只吸收中枢神经系统的营养。 但是这位保镖不是很挑剔，他经常不会错过治疗中枢神经系统所需的药物。 事实证明，以我们的健康为目标的系统可能成为其治疗的障碍。 这是生理学上的讽刺意味。

但是，血脑屏障并不总是像瑞士表那样起作用。 在中风，肿瘤，各种头部受伤，慢性疾病的情况下，血脑屏障开始衰竭，也就是说，使中枢神经系统恢复原本可以消除的功能。 除了失败的自然原因外，还有人为因素：聚焦的高强度超声和渗透剂破坏了血脑屏障。 你问为什么要破坏能确保大脑正常运作的东西。 然后，要交付成熟的BBB可以过滤出的药物。 无论如何，保镖不会让医生晕倒的访客进入俱乐部，因为他没有俱乐部卡。

在所有情况下，主要和普遍的BBB破坏的结果是大脑的细胞外基质（ECM）的病理暴露，在正常情况下是隔离的。

细胞外基质是结缔组织的基础，结缔组织为细胞和化学物质的运输提供机械支持。

因此，科学家认为，通过以病理紊乱的BBB靶向大脑的某些部位，可以将药物递送到受损的中枢神经系统的那些原本由于BBB而无法进入的部位。

因此，有可能产生针对ECM的配体，该配体将有效地对抗中枢神经系统的各种疾病，而不是像先前开发的方法那样针对一种特定疾病。

为了在实践中检验该理论，科学家决定将其药物递送方法应用于不可治愈的胶质母细胞瘤（脑癌）。 这种疾病很少见，但很难克服。 即使在化学疗法，放射疗法和外科手术之后，存活期约为1-2年。

最近的研究表明，通过基于 白介素13 * 的嵌合抗原受体*的免疫疗法的应用是成胶质细胞瘤的一种有前途的治疗方法。

白细胞介素*是白细胞产生的肽信息分子，在较小程度上是吞噬细胞和其他组织产生的。 白介素是免疫系统的一部分。

白细胞介素13 * （IL13）是许多组织中由过敏性炎症引起的生理变化的主要介质。

嵌合抗原受体*是一种重组融合蛋白，它连接可以选择性结合特异性抗原和激活T细胞的信号域的抗体片段。

靶向CSPG4蛋白的嵌合抗原受体的使用也可以是对抗胶质母细胞瘤的相当有效的方法。

此外，MRI分析显示胶质母细胞瘤内部的血脑屏障受到侵犯。 因此，与细胞外基质有关的治疗必须有效。

在这里，科学家的巨大想象力和创造力进入了现场。 事实是您可以将标准的肽段和抗体用作ECM靶向试剂，但这并不是那么有趣。 因此，科学家决定使用可变淋巴细胞受体（VLR），即七lamp鳗抗原受体。


七lamp鳗类大约有40种，其中大多数是以鱼血为食的寄生虫，它们被它们吸食。

VLR是富含镰刀蛋白，富含亮氨酸的蛋白，可与基于免疫球蛋白的抗体相比，以特异性和亲和力识别抗原靶标。

亲和力*是诸如抗原和抗体之类物质相互作用强度的热力学特征。

为什么要精确选择七lamp鳗及其VLR？ 事实是，在哺乳动物和七lamp鳗之间有5亿年的进化深渊。 因此，七lamp鳗VLR比哺乳动物抗体更可能识别ECM中的保守蛋白和聚糖。

为了识别与大脑ECM结合的VLR，科学家进行了淘选，这是一种从VLR生物分子文库中选择特定生物元素（蛋白质，小分子等）的方法。 结果是ECM结合克隆*的集合。

克隆* -一组具有相同祖先（主要来源）的相同单元格，也就是说，它们来自同一单元格。

所得克隆在具有BBB渗透性疾病或成胶质细胞瘤的动物中均显示出优先积累在血脑屏障的破坏区域。 另外，该克隆很好地针对载有阿霉素（抗生素）的脂质体 。

脂质体 -球形细胞内细胞器，用于将药物递送到某些组织。

学习准备

正如我们先前所了解的那样，通过平移VLR库来识别ECM绑定VLR。 该文库本身是从用机械分离的小鼠大脑微脉管系统的质膜制备的七lamp鳗VLR集合中获得的，该小鼠大脑微血管的质膜含有相关的大脑ECM。

首先在培养的小鼠内皮细胞（bEnd.3细胞系）产生的脱细胞* ECM上使用两个淘选周期，使该库富含ECM结合物。

脱细胞*是一种从细胞成分中纯化同种异体移植物的方法，该方法可基于天然细胞外基质获得非免疫原性，有效和安全的构建体。

此外，有必要准确鉴定主要弯曲bEnd.3 ECM的那些ECM结合克隆，而不是小鼠成纤维细胞ECM（细胞系3T3）的对照组。

接下来，将单个克隆置于96孔板中，然后将其扩增并诱导展示VLR。 除去多余的克隆（因此没有亚克隆）后，科学家们能够使用ELISA筛选（ 1a ）对VLR与bEnd.3和3T3 ECM的结合进行比较评估。


图片编号1

总共分析了285个克隆。 结果，可以看出，具有bEnd.3 ECM的通信信号比具有3T3 ECM（ 1b ）的通信信号强大约5倍。

接下来，通过比较与bEnd.3和3T3 ECM（ 1C ）相关的克隆的明视野显微镜图像检查ELISA结果。

从图像1c中可以看出，克隆P1C10和P2C7仅与bEnd.3 ECM结合，而非结合克隆P1E9实际上与任何类型的ECM没有任何联系。

接下来，科学家对小鼠大脑的一部分进行了比较实用的方法的比较分析。 在以前的观察中显示最佳结合结果的10个VLR克隆中，有8个在此分析中也显示出结合（ 1d ）。

所有结合克隆均显示出弥散的实质性EMC方案，没有任何额外的富集（血管或细胞）。

科学家根据以上所有观察结果（P1C10和P3A8）确定了2位领导者。 将来将考虑使用这些克隆。

研究成果

P1C10和P3A8用Cy5荧光染料官能化。 使用VLR-Cy5偶联物对鼠类组织进行直接免疫染色显示，与肾脏，心脏和肝脏的组织相比，P1C10-Cy5对大脑的ECM具有显着的选择性（ 2a ）。


图片编号2a

免疫染色* -一种过程，可让您在细胞，组织或器官的特定区域识别和定位抗原。

但是，P3A8-Cy5以相同的强度结合到脑和肝ECM，但是像P1C10-Cy5一样，对肾脏和心脏ECM却没有兴趣。

接下来，科学家测试了P1C10与人脑ECM的交叉反应性（使用了冷冻切片）。 P1C10-Cy5与人脑ECM的结合类似于同一过程的图片，但涉及小鼠脑（ 2b ）。 P1C10-Cy5在人胶质母细胞瘤样品的冰冻切片中也成功与ECM结合（ 2c ）。


图像编号2b-e

根据这些观察结果，科学家们测量了* P1C10的亲和力 。

亲和力* -细胞捕获并结合某些化学物质的能力。

结果，与bEnd.3 ECM结合的解离常数（Kd）为48.38±6.05 nM（ 2d ）。

此后，科学家决定检查P1C10是否会在破坏小鼠大脑BBB的地方积聚。

经染料修饰的近红外IR800克隆P1C10或RBC36以1 mg / kg的体积引入健康的实验小鼠 RBC36是一种VLR，可识别人H抗原的三糖，因此被用作同种型对照。

接下来，给小鼠静脉内注射甘露醇（六元醇）以暂时打开血脑屏障。 之后，拍摄小鼠的大脑图像以识别IR800信号（下图）。


图片编号3

对比分析表明，使用P1C10-IR800时，大脑中荧光的积累（用IR800染料标记的测试物质的浓度）是RBC36-IR800的3.3倍，是使用生理盐水时的7.6倍。 因此，P1C10在血脑屏障发生故障后选择性地积聚在大脑中。

接下来，科学家决定检查VLR是否会靶向裸露的细胞外基质。 为此，使用鼠GL261和人胶质母细胞瘤U87细胞创建了两个模型，将它们引入实验小鼠的大脑。 结果，形成具有混沌脉管系统和血脑屏障的点障碍的肿瘤。

将P1C10或RBC36的体积为1 mg / kg静脉内施用于患有GB261胶质母细胞瘤的小鼠。 30分钟后，采集大脑样本以分析和可视化IR800信号（P1C10或RBC36的染料）。


图片编号4

注射P1C10-IR800的小鼠中GL261肿瘤区域的平均荧光强度是大脑对侧（相反）区域的平均荧光强度的112倍（ 4a ）。 但是当使用RBC36-IR800时，肿瘤区域的荧光强度仅是相对区域的荧光强度的9倍。

另外，发现P1C10-IR800在肿瘤本身中的蓄积比RBC36-IR800的蓄积高13倍。

这些观察结果证实了P1C10选择性靶向小鼠肿瘤中ECM的能力。 现在有必要在人脑肿瘤上测试这种才能。

对患有U87（人脑肿瘤）的小鼠施用VLR。 科学家不仅测试了P1C10，还测试了192，它显示了与肾脏，肝脏和ECM的血管选择性结合到大脑脉管系统的基底外侧的能力。

静脉内施用3 mg / kg的P1C10、192或RBC36，并使其自由循环30分钟。 之后，采集感兴趣器官的样品以使结果可视化。

两个VLR克隆（P1C10和192）均在肿瘤边界处聚集，P1C10分布在整个肿瘤ECM中（ 4b ）。 但是192大部分集中在大的肿瘤血管之外。

VLR克隆中没有一个在小鼠大脑健康的对侧半球中积累。 在健康的和大脑中含有肿瘤的部分中，RBC36完全不存在。

定量分析表明，P1C10在U87肿瘤中的蓄积是脑对侧区域的21.2倍，是肾脏的21.2倍，是肝脏的15.9倍，是心脏的29.6倍。

P1C10和192在肿瘤区域的积累比RBC36的积累大25.4和11.9倍。 同时，两个VLR克隆主要聚集在肿瘤的血管缺陷区域。

这些观察结果证实了P1C10的有效性及其对大脑ECM的选择性关注。 P1C10是否可以有效地将药物运送到需要的地方还有待观察。

科学家将VLR与负载阿霉素的脂质体结合使用，由于其自​​身的荧光性，该脂质体高度可视化，大大简化了VLR有效性分析过程。 获得的脂质体的平均直径为94.2 nm，阿霉素含量为1-2 mg / ml。 接下来，将VLR克隆连接到脂质体，合并后保留其结合活性（图5）。


图片编号5

为证明用靶向VLR的阿霉素脂质体治疗的可行性，将肿瘤U87细胞（在bEnd.3 ECM上培养）与靶向P1C10或RBC36的阿霉素脂质体一起孵育。

观察结果表明，靶向P1C10的脂质体在破坏的细胞中有明显的生长。 P1C10的半最大有效浓度为199.0±1.7 nM，RBC36的半最大有效浓度为3312.0±-2.6。


图片编号6

最后，科学家测试了靶向病理受损的脑细胞外基质的潜在治疗作用。 为此，将载有阿霉素的脂质体与P1C10、192或RBC36组合用于具有U87癌细胞的实验小鼠。

从图像6a和6b中可以看出，使用P1C10时来自阿霉素的信号要强得多。 可以看出，该信号在肿瘤内充分定位，并且不影响大脑的对侧（健康）区域。

图片6c和6d证明，P1C10在肿瘤区域的蓄积比健康区域高7.6倍。 如果我们将P1C10与RBC36的积累程度进行比较，则P1C10的差异是7.9倍。

持续4周（在第7、14、21和28天），使用P1C10、192或RBC36向具有U87的实验小鼠施用12 mg / kg的阿霉素。

引入肿瘤后，中位生存期为：P1C10为43天，192为30天，RBC36为28天。

与其他两组相比，一组患有P1C10的受试者的生存率显着提高。 同时，指标192和RBC36与根本没有接受治疗的对照组的指标没有显着差异。

要更详尽地了解这项研究的细微差别，建议您研究一下科学家的报告 。

结语

不会有幸福，但不幸却有所帮助。 使用这个短语，您可以相当准确地描述这项研究。 科学家使用血脑屏障的病理性疾病作为一种工具，将药物输送到受肿瘤影响的大脑某些区域，同时避开健康区域。 正如他们所说，科学家从没有等待的地方就获得了这项复杂而崇高的努力的帮助。 可变受体淋巴细胞（VLR）七lamp鳗成为这项工作的基础。 现在可以肯定地说，寄生虫也可能有用。

脑肿瘤的治疗充满了巨大的困难，而这一过程的成功并不如我们所希望的那样大。 创造新的方法和手段来对抗这种严重的疾病确实是科学的目的。 了解我们周围和内部的世界，我们不会违背自然的意愿，我们只会更好地理解它，找到新知识并将其永久应用。


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