在阅读此升级之前，建议您熟悉先前发布的源代码 。由牛津纳米孔技术公司（ONT）开发的首个也是最受欢迎的纳米离子孔测序仪MinION（在英国的最低价格为1000美元，在俄罗斯为15万卢布）可在一次性电池上运行，每个电池的成本为900美元（俄罗斯-13.5万卢布。 这样的细胞可以让您在2 ... 3天内数字化10 ... 20 Gb DNA。 对于人类基因组测序，这太少了（您需要> 100 Gb），但是对于所有其他临床诊断目的来说，这太了（<1 Gb就足够了）。
最近开始销售生产效率更高（且价格更高）的型号-PromethION 24/48（$ 165,000 / $ 285,000），主要针对全基因组在线测序。 更昂贵的是其更高效的耗材（每单位2,000美元，> 100 Gb）。 没错，它们的散装成本可以更低（2,880个，180万美元，625美元/个）。但是，俄罗斯的预算不允许这种采购（每批200 ... 2.5亿卢布）。
而且不仅限于俄语。 因此，最近开始进行ONT会议（5月22日至24日）的参观者的注意力吸引了宣布开始销售Flongle的消息.Flongle是MinION测序仪的适配器插入件，允许使用效率较低（〜1 Gb）但相对便宜（90美元）的一次性电池。
https://nanoporetech.com/productsFlongle的出现可以在临床实践中使用NGS（下一代测序）引起爆炸性增长，并取代传统的PCR诊断程序，后者在俄罗斯的市场规模超过10亿卢布，在世界范围内以数十亿美元衡量。 但是对于大多数俄罗斯患者来说，NGS诊断仍将是不可取的奢侈品，因为Flongle细胞在国内市场的成本将超过1万卢布。 如果我们加上消耗性试剂的成本，运输成本和管理费用，那么测序一种DNA / RNA样品的估计成本将不会低于2万卢布。
这意味着需要开发家用纳米孔测序仪，并为其提供廉价的消耗品和试剂。
纳米骑手
通过为Flongle重用细胞并导入替换它们所需的消耗性试剂，可以大大减少纳米孔测序。 但是首先，您需要获得一种测试设备，该设备可以监控工作细胞的126孔中的双层脂质膜（BLM）的形成，并评估嵌在这些膜中的纳米孔的数量和质量。 这种设备（“ Nanorider”？）应该跟踪在单个孔上形成BLM期间各个孔的电导率（和/或阻抗）的变化，并记录流过单个离子通道的皮安电流。
可以通过以下标准组件构成通过USB 2.0连接到计算机的阅读器，这些元素包括：FPGA（100 ... 200 $），电流放大器（MAX9923FEUB-200 ... 300卢布），ADC（1 ... 2000卢布），等等。仅带有非标准接触垫（10x13）类型LGA（地栅阵列）的电路板可与Flongle的单元对接。 或者使用简化的家用副本，其中包含较少数量（16 ... 32）的传感器孔。
触摸板电池跳线将计算出的细胞生产率降低4 ... 8倍（最高10 ... 20 Mb）对于解决许多问题（确定病原体，HLA分型，建立亲子关系，识别人等）并不重要，但是它允许您使用常规放大器组装纳米孔测序仪皮安电流。 并且不使用特殊的512通道芯片，牛津人已经投入了数千万美元用于开发。 的确，每个多通道纳米阅读器必须包含十几个电流放大器+ ADC，但其价格仍比专有的MinION + Flongle组合（> 20万卢布）便宜几倍。 至于纳米阅读器的低性能，对于没有像样的计算机的俄罗斯用户（医生，生物学家，生物黑客等），它甚至可能是有用的。
基洛里德
牛津人开发的512通道皮安电流放大器包含在MinION的每个一次性电池中。 废物细胞可以扔掉，但是最好使用其中包含的芯片来生产以提高生产率为特征的Flongle类似物。 如果这些芯片配备了表面触点，则它们将能够与包含2048（512x4）传感器孔的接触单元一起工作。
使用这样的LGA设计单元并非易事，但您需要考虑的是，此处的接触要求不如处理器和母板严格，在这种情况下，不良的接触会导致整个系统瘫痪。 对于定序器，甚至一半的电池触点的不可操作性也可以认为是可接受的。 剩下的一半足以确保5 ... 10 Gb的性能。
这种想法的逻辑发展将是在一台设备中多个类似阅读器的组合。 这将使您获得模拟定序器GridION X5，其设计用于与五个（或更多）可重复使用的国内生产单元同时工作。 在许多临床诊断实验室中可能需要这种测序仪。
https://store.nanoporetech.com/devices一次性PromethION测序仪单元在芯片上包含9,000个传感器孔。 芯片本身就是3000通道的皮安电流放大器。 他们使用24个（PromethION 24）或48个（PromethION 48）信息单元发出的信息流太大，以至于无法以原始形式将其传输到常规外部计算机。 因此，这种类型的音序器必须配备自己的超级计算机。 但是，如果该音序器仅适用于一个电池，则可以将其连接到具有Thunderbolt 3.0端口的常规游戏笔记本电脑。
从ONT更改免费（弹出）芯片以与接触单元配合使用不是一个不可解决的问题。 但是基于这种芯片构建的音序器只能与ONT软件一起使用。 而且必须花费在重建这些程序上的努力才能抵消使用现成芯片的好处。 从头开发这样的芯片太昂贵了。
超级骑士
今年，将开始对来自AXBIO（USA）的纳米孔测序仪进行beta测试。 它使用由以色列公司Tower Semiconductor Ltd在日本生产的具有一百万个电流放大通道的芯片。耗材和这些定序器的销售将由AXBIO的中国分公司处理。
在美国和欧盟，纳米孔测序已获得7,000多项专利，这给试图使用此类技术的本地公司带来了不可预测的财务风险。 显然，这是这种发展如此高度国际化的主要原因。 而且，它允许俄罗斯的公司和实验室不受任何限制地参与测试和改进AXBIO技术，以及在自己的领土上生产（或收集）此类音序器。
通过具有百万像素芯片（兆读取器）的纳米孔定序器获得的太字节原始数据，需要进行过滤。 并仅将最长和最高质量的读数传输到计算机。 这不仅会提高测序质量，而且会降低计算机的需求，这对于大规模生产和广泛使用基因组测序仪也很重要。 此外，超大型阅读器的过高生产率可以将人类基因组测序的持续时间从2到3天（对于ONT）减少到几个小时。
技术总和
通过对纳米孔测序技术的五个主要要素（膜，纳米孔，“马达”（螺旋），测序条件和读取信号的解码算法）进行并行管线优化，可以促进ONT的成功。
https://nanoporetech.com/resource-centre/videos/sub1000用于纳米孔测序的细胞保质期主要取决于双层脂质膜的稳定性。 现在是6周，尽管通常这种膜会在几天内被破坏。 为了增加它们的保存期限，使用了疏水性聚合物添加剂，表面活性的嵌段共聚物，胆固醇，抗氧化剂，脂肪酸的交联等，并且这种修饰会干扰离子通道的形成。 因此，实现BLM稳定性非常困难。
彻底解决该问题，可以在测序仪的工作单元中形成膜，并在使用前立即将纳米孔引入其中。 自我准备工作的细胞将为其再生和再利用提供机会。 至于保存期限，对于干电池几乎没有限制，其激活和再生所必需的试剂可以保存数月。
纳米线测序技术的瓶颈同时也是纳米孔的瓶颈，读取信息的质量取决于纳米孔的瓶颈。 因此，ONT的主要任务之一是寻找膜蛋白，从而获得可接受质量的结果。
第一个这样的蛋白质是CsgG，这是在许多革兰氏阴性细菌中发现的外膜蛋白质。 它的九个亚基在膜中形成一个离子通道，具有宽阔的入口和出口前庭和一个瓶颈。 但是，只有在枚举并分析数百种修饰的CsgG变体后，才可能获得足够高质量的纳米孔（R9，R9.4.1，R9.5.1）。 今年夏天，具有下一代毛孔（R10或R10b）的细胞应上市销售，以提高读取均聚物重复序列的准确性。
https://nanoporetech.com/about-us/news/london-calling-clive-brown-and-team-plenaryONT是ONT纳米孔测序技术（解旋酶）的必不可少的成分，解旋酶是一种展开双链DNA并抑制单链DNA通过纳米孔前进的分子马达。 尽管MinION电子组件的速度允许将其提高到每秒1000个核苷酸，但通过这种电机解开DNA的最大速度现在达到了每秒450个核苷酸对。 从理论上讲，加速解旋酶的工作可以使MinION的性能提高一倍，但是在实践中，这可能导致测序效果不佳。 因此，更快，更有效的解旋酶不太可能改善纳米孔测序仪（如MinION和PromethION）的性能。
测序的质量取决于许多条件-施加到膜上的电压的大小，反应混合物的电导率和离子组成，堵塞孔的杂质的数量和性质，通过改变电势的极性来清洁堵塞的孔的能力，所用衔接子的结构等，等等...因此，纳米孔测序需要仔细优化其所有参数和工作溶液的组成（运行条件），这可能会对核苷酸序列数字化的质量产生不利影响 芒。 例如，最近显示，通过解旋酶切割的ATP浓度的降低逐渐降低了测序结果的准确性，现在牛津人正试图通过将ATP再生系统引入反应混合物中来消除该问题。
纳米孔测序技术的第五个要素是建立在循环神经网络（RNN）上的人工智能，它使用一些特殊的算法和程序来改善对同质重复序列的识别（Flip-flop，Medaka）。 7月，应该发布Guppi和MinKNOW程序的下一个版本，其中牛津大学承诺增加确定甲基化碱基（5mC和6mA）的能力。 这不仅对于表观基因组研究很重要，而且对于提高对常规碱基的认识也很重要。
纳米孔定序器读取的大量信息及其处理的复杂性对此类软件和硬件系统的硬件提出了更高的要求。 因此，并非每台计算机都适合连接MinION，最新一代的图形加速器已安装在GridION和PromethION中，牛津纳米孔技术公司成为大批用于人工智能设备的Jetson AGX Xavier（NVIDIA）模块的首批购买者之一。
最近，人们认为纳米孔技术无非是对更精确的荧光和半导体测序技术的有用补充。 但是读取DNA的准确性的逐步提高，加上较长的可读序列，使它（如果不能领先于所有竞争者）至少可以确定基因组测序技术发展的主要载体。
掌握纳米孔测序技术的所有要素可能需要花费相当长的时间，但这不是最大的问题。 主要问题是缺乏针对俄罗斯这种综合发展的有针对性的资金。 没错，最近批准的《 2019-2027年联邦遗传技术开发科学技术计划》（“计划实施方向”一节）说，将在短期内（3至6年）开发一种用于高性能基因组测序的原型设备。 但是，要在30页文字中找到这一行并不是一件容易的事。 与中国人就购买AXBIO音序器进行谈判更容易。
更简单的是找到可以在膝盖上组装最简单的纳米骑手的工匠。 然后伸出双手去寻找那些同意资助国内纳米孔测序技术发展的投资者。