去世的诺贝尔奖获得者凯里·穆利斯（Carey Mullis）-DNA聚合酶链反应的发明者

在美国，享年74岁的化学诺贝尔奖获得者凯里·穆利斯（Carey Mullis）去世。 据他的妻子说，死亡发生在8月7日。 原因是由于肺炎引起的心脏和呼吸衰竭。

DNA分子的发现者詹姆斯·沃森（James Watson）将向我们介绍他对生物化学的贡献以及他获得的诺贝尔奖。

摘自詹姆斯·沃森，安德鲁·贝里，凯文·戴维斯的书

脱氧核糖核酸 基因革命的历史

第7章。人类基因组。 生活剧本

...
聚合酶链反应（PCR）于1983年由在Cetus工作的生物化学家Cary Mullis发明。 该反应的发现是非常了不起的。 穆利斯后来回忆道：“ 1983年4月的一个星期五晚上，它似乎照亮了我。 我开车，沿着月光蜿蜒的山路驶往北加州，红杉林的边缘。” 令人印象深刻的是，在这种情况下他受到了启发。 而且，在加利福尼亚北部，根本没有什么可以促进洞察力的特殊道路。 只是他的朋友曾经看到Mullis沿着一条冰冷的双向道路鲁rush地冲着，这丝毫没有打扰他。 一位朋友告诉《纽约时报》：“穆利斯梦想着撞上红杉会死。 因此，如果沿途没有红木生长，他不怕开车。” 沿途的红杉使穆利斯专心致志，这才是真知灼见。 穆利斯因其1993年的发明而获得了诺贝尔化学奖，从那以后他的行为就变得更加陌生。 例如，他是修正主义理论的支持者，即艾滋病与艾滋病毒无关，这大大损害了艾滋病毒自身的声誉并阻止了医生。

PCR是一个相当简单的反应。 为此，我们需要两个化学合成的引物，它们与所需DNA片段不同链的相反末端互补。 引物是单链DNA的短片段，每个片段长约20个碱基对。 引物的特殊性在于它们对应于您要扩增的DNA区域，即DNA模板。


（图片可点击）PCR的发明者Cary Mullis

PCR的特异性基于基质和引物（短的合成寡核苷酸）之间互补互补复合物的形成。 每个引物与双链基质的一条链互补，并限制了扩增区域的开始和末端。 实际上，最终的“矩阵”代表了整个基因组，我们的目标是从中分离出我们感兴趣的片段。 为此，将双链DNA模板加热到95°C几分钟，以便分散DNA链。 该阶段称为变性，因为两条DNA链之间的氢键被破坏了。 当链打开时，温度降低，从而引物可以接触单链模板。 DNA聚合酶通过结合核苷酸链的长度来开始DNA复制。 DNA聚合酶使用引物作为种子或复制实例复制模板链。 作为第一个循环的结果，我们获得了特定DNA区域的多个顺序加倍。 接下来，我们重复此过程。 在每个循环之后，我们以两倍的数量获得目标区域。 经过25个PCR循环（即不到两个小时），我们得到的目标DNA区域的数量是原始DNA的225倍（也就是说，我们将其扩增了约3,400万倍）。 实际上，在入口处，我们得到了引物，模板DNA，DNA聚合酶和游离碱A，C，G和T的混合物，特定反应产物（受引物限制）的数量呈指数增长，“长” DNA拷贝数呈线性，因此反应产物占主导地位。


所需DNA位点的扩增：聚合酶链反应

PCR初期，主要问题如下：在每个加热-冷却循环后，必须将DNA聚合酶添加到反应混合物中，因为它在95°C时失活了。 因此，有必要在25个循环中的每个循环之前重新添加它。 该反应过程是相对无效的，需要大量时间和聚合酶，并且该材料非常昂贵。 幸运的是，大自然母亲来了。 许多动物在高于37°C的温度下都会感到舒适。 为什么37°C的温度对我们变得重要？ 发生这种情况的原因是，此温度对大肠杆菌最适，最初从中获得了用于PCR的聚合酶。 在自然界中，有些微生物的蛋白质在数百万年的自然选择中已变得对高温更具抵抗力。 已经提出使用嗜热细菌的DNA聚合酶。 这些酶是热稳定的，并且能够承受许多反应周期。 它们的使用使得简化和自动化PCR成为可能。 从生活在黄石国家公园温泉中的水生栖热菌中分离出一种最早的热稳定DNA聚合酶，称为Taq聚合酶。

PCR很快成为人类基因组计划的主要力量。 通常，该过程与Mullis开发的过程没有什么不同，它只是自动化的。 我们不再依赖盲目的研究生人群，他们将艰辛的液体滴入塑料管中。 在进行分子遗传研究的现代实验室中，这项工作是在机器人传送带上进行的。 参与人类基因组之类的大规模测序项目的PCR机器人正在不懈地致力于处理大量耐热聚合酶。 PCR基因的专利持有者，欧洲工业和制药业巨头霍夫曼-拉罗什（Hoffmann-LaRoche）加大了消耗品成本，为人类基因组计划工作的一些科学家感到愤怒。

另一个“驱动力”是DNA测序方法本身。 当时，这种方法的化学基础不再是新颖的：州际人类基因组计划（HGP）采用了与Fred Senger在1970年代中期开发的相同的巧妙方法。 创新之处在于测序过程中实现的自动化程度和程度。

自动测序最初是在加利福尼亚理工学院的李·胡德实验室开发的。 他毕业于蒙大拿州的高中，曾作为前锋踢过美式足球。 多亏胡德，车队不止一次获得了州冠军。 在他的科学生涯中，团队合作技能对他非常有用。 胡德的实验室聘请了由化学家，生物学家和工程师组成的杂色公司，不久他的实验室成为技术创新的领导者。

实际上，自动排序的方法是劳埃德·史密斯（Lloyd Smith）和迈克·洪克皮勒（Mike Hunkapiller）发明的。 当时在胡德实验室工作的迈克·汉库皮勒（Mike Hunkapiller）求助于劳埃德·史密斯（Lloyd Smith），为他提供了一种改进的排序方法，该方法可以将每种类型的底漆分别涂成自己的颜色。 这样的想法可以使Senger流程的效率提高四倍。 Sanger在DNA聚合酶的参与下在四个试管中的每个试管中进行测序（根据碱基数）时，会形成一组独特的不同长度的寡核苷酸，包括引物序列。 接下来，将甲酰胺添加到管中以分离链，并在四个轨道上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。 在Smith和Hunkapiller变体中，双脱氧核苷酸用四种不同的染料标记，PCR在一根试管中进行。 然后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳期间，凝胶中特定位置的激光束激发染料的活性，检测器确定当前正在通过凝胶迁移的核苷酸。 起初，史密斯是悲观主义者-他担心使用超低剂量的染料会导致核苷酸区域难以区分的事实。 但是，由于精通激光技术，他很快找到了一种使用特殊的荧光染料的方法，该染料在激光辐射的影响下发出荧光。


（完整版本请点击 -4.08 MB）小字体：使用从自动测序仪获得的自动测序仪对DNA序列进行解码。 每种颜色都有四个基数之一。

在Sanger方法的经典版本中，被分析的DNA的一条链充当通过DNA聚合酶合成互补链的基质，然后在凝胶中按大小对DNA片段的序列进行分类。 合成过程中DNA中包含的每个片段，随后允许反应产物可视化的每个片段，都用对应于末端碱基的荧光染料标记（在第124页上进行了讨论）； 因此，该片段的荧光将是给定碱基的标识符。 然后剩下的只是进行检测和可视化反应产物。 使用计算机分析结果，并显示为对应于四个核苷酸的多色峰序列。 此外，信息直接传输到计算机信息系统，这消除了耗时且有时很痛苦的数据输入过程，这大大增加了排序的难度。

»这本书的更多信息可以在出版商的网站上找到
» 目录
» 摘录

对于Khabrozhiteley优惠券25％的折扣-PCR