Oisin Biotechnologies是出现在我们与
Methuselah Foundation和
SENS Research Foundation相关的支持者和研究人员社区中的众多公司之一。
Oisin代表正在开发一个平台，该平台可以根据这些细胞表达的特定蛋白质来选择性破坏细胞。 他们的最初目标是衰老细胞和癌细胞。 首先，由于成功的癌症治疗方法比许多其他疗法更易于调节，因此他们将把抗癌治疗方法引入临床试验。
这将使他们能够重复使用该技术，为随后的
柔脂疗法试验做准备，该技术能够从不同组织中
清除许多衰老细胞。 在2018年初由SENS研究基金会和
永远健康基金会组织的
抗衰老会议上，Oisin生物技术CSO约翰·刘易斯（John Lewis）谈到了他们的技术和新成果。
性能表现
大家晚上好！ 很高兴参加这次会议。 我衷心感谢
Aubrey de Gray和
Michael Greve的邀请。 我什至不能要求一个更好的顺序，因为前一位发言人做了出色的工作，强调了衰老细胞为何如此重要以及为什么它们是这样的问题的原因。 尽管我在杀死细胞方面拥有丰富的经验，但我还是
肿瘤学的学术科学家和衰老领域的初学者，我现在想谈一谈：Oisin生物技术如何开发出一种非常有选择性的疗法来破坏衰老细胞和癌症。
我不会谈论什么是敏感细胞或它们的作用。 简而言之，这些细胞是人体对外部应激（
氧化应激 ，
遗传毒性应激）的反应而产生的细胞，它们主要抑制癌症的发展。 同样重要的是要注意，随着细胞衰老，它们还会发送
在体内传播的信号。 我再说一遍，我们没有衰老细胞的通用标记。 我们可以使用一些共同的特征来对其进行识别。
例如，活性
酶在
溶酶体中的积累。 我们可以对活性
β-半乳糖苷酶 染色 。 但是实际上，这是一个非常不同的群体，它们以不同的方式出现。 我不想赘述，我只强调
细胞周期完成的启动受几个因素控制：
p16 ，
p21 ，
p53 。 我们对此进行了思考，并问：创建消除这些细胞的靶向疗法的常见途径是什么？ 我不需要重复一遍，尽管衰老细胞参与了衰老过程，但也存在一些非常特殊的疾病，它们是衰老的症状，可以使用相同的技术进行临床治疗。
在上一次对话中，重要的一点是p16可能不是全部。 但是，您需要查看过去几年研究的数据-这确实使我确信-当然，所有衰老细胞都可能不表达p16，但是在小鼠模型中，很明显，如果以这种方式设计您可以有选择地破坏所有表达p16的细胞，从而使表型发生显着变化。 对我来说，这真是令人印象深刻。
例如， 约翰·范·迪尔森 （ John van Deyrsen）的工作中，使用所谓的INK-ATTAC caspase-9系统对表达由p16 启动子驱动的自杀基因进行基因改造的小鼠，使它们能够使用二聚体来激活表达p16的细胞的凋亡。 这些小鼠的表型发生了惊人的变化。 健康显着改善，平均预期寿命增加25％，癌症减少50％，以及功能变化： 白内障形成减少， 无力减少和脱发减少。
作为演讲的介绍，我将显示一些最近发布的数据。 他们让我认为这值得作为一种疗法-这是
Peter de Keyser去年发表的论文，它使用p53和
FOXO4机制。 他能够使用加速衰老模型，掉毛的小鼠变得虚弱，并表明在这些变化已经发生后去除衰老细胞可以改变它们。 对我来说，这确实证实了衰老细胞的破坏是正确的发展道路这一事实。
因此，这是Oisin技术的基础。 作为一个工程团队，我们认为，即使在开发可用于治疗特定疾病的疗法的过程中，我们也一直在考虑衰老，以及在临床检查有效性后如何在将来使用它。 因此，我们想使用类似的策略，使用我们当时开发的现代动物模型。 我们想要开发一种具有良好耐受性的低毒性曲线，并且可以循环重复进行。
非免疫原性且无副作用的物质。 显然，许多衰老表型是组织特异性的，将治疗靶向不同组织的能力将是一个优势。
今天我要告诉您的是我们开发的Oisin技术。 它称为SENSOlytic平台。 这是一个脂质纳米颗粒平台（LNP），其中包含不可整合的DNA质粒 。 它被设计为由化学二聚体激活，该化学二聚体引发非常快速且不可逆的凋亡反应。 也许最重要的部分是药物递送系统-能够将质粒DNA全身性递送到不同组织而没有明显毒性的能力。 Oisin开发了一种基于质粒的多用途技术，与干扰RNA或信使RNA不同 ，质粒可以经过精心设计，仅在激活特定途径（例如p16，p21或p53）时才激活。 但是，它们也可以设计有增强剂或阻遏剂，并靶向特定的组织或疾病。 我们创建了一个在各种条件下都有效的系统和设计库。 我今天将向您展示的其中两个是p16和p53启动子的版本，包括自杀基因。
我们创建了一个质粒文库，该质粒基本上是与iCas9诱导的自杀基因相关的特定选择性启动子，然后使用化学二聚体将其掺入或二聚化。 你们中的许多人以前可能已经见过，但是iCas9是一种经过修饰的caspase，因此已被截断，
包含域已被删除，
并由FKBP二聚化
域取代。 这些区域与安全的AP20187化学二聚体或其临床类似物AP1903有非常强的相互作用，如II期临床试验所示。 在此系统中，真正的好处是，在我们这种情况下，您只能在具有p16或p53活性表达的细胞中暂时表达质粒的基因。 在添加二聚体之前，什么也不会发生。 低
分子量二聚体具有很好的耐受性，可在几分钟内使所有组织饱和，并引起不可逆的凋亡反应。 在这些条件下，iCas9会二聚化，自我裂解，激活
凋亡小体的形成，并在2至3小时内引起非常快速的细胞死亡。 细胞无法抵抗这一点。 他们无法进化或以其他方式抵抗它。
我们的一些
体外研究使用了胎盘
成肌纤维细胞系IMR-90。 在这种情况下，我们使用10
度辐射诱导衰老
，并使用iCas9
转染细胞。 iCas9略小于caspase-9，可以用caspase-9
抗体检测到。 在未辐照的细胞中，没有iCas9的表达。 在细胞通过表达p16衰老的情况下，iCas9诱导开始，当我们在这些细胞中加入一点二聚体时，它就会消失。 培养物很快清除了这些细胞。 然后，当我们观察杀死这些细胞的能力时，我们在活力测试中看到成功被质粒转染的每个细胞都死亡。 我们进行了其他实验。 我只是展示一个使用
流式细胞仪的例子，我们确认我们正在引起这些细胞的凋亡。
因此，我们有一个质粒对表达p16的细胞具有很高的选择性。 我们可以通过添加二聚体来迅速杀死它们。 问题是我们如何将其转变为对人类有效的疗法。 需要一种传送机制，非常有效和安全。 我们决定使用脂质纳米颗粒。 脂质纳米颗粒已经使用了很多年，我想说有很多承诺和投资，但很少有成功。 波士顿的
Alnylam制药公司最近通过mRNA制剂成功地进行了III期试验，问题是脂质纳米颗粒通常在肝脏中蓄积，其向细胞的
核酸传递机制使用正电荷。 这是一项非常简单的技术。 他们产生带正电荷的脂质。 如果使用正电荷，它们很容易刺穿
膜上的孔，并且可以有效地将物质沉积到细胞中，除非它们有剧毒。 因此，它们的安全剂量非常低。
为此，几家公司开发了所谓的
有条件的阳离子脂质 。 这种
脂质通常在血液中呈中性，进入内体并在酸性环境中变为
阳离子 。 它们是正在进行的通过脂质纳米颗粒临床试验的程序的主题。 它们起作用，但仍然有剧毒。 理想的递送系统是可以使用中性脂质以及核酸细胞递送的另一种机制的系统。 我将告诉您一些有关我们如何来到他身边的信息。 如果您有脂质纳米颗粒，并且需要进入细胞内部，则它必须在所有保护下穿过质膜。 病毒已经发展了数百万年，解决了这个问题，并且已经开发出许多
融合蛋白 。 这些蛋白质美丽，巨大且优雅，它们将膜连接在一起，形成毛孔和混合脂质的方式确实很棒，但是您无法将它们附着在脂质纳米颗粒上，因为它们是具有巨大活性中心和高免疫原性的大蛋白质。
幸运的是，有一位加拿大科学家一生都在研究这些融合型正
咽病毒 ，发现它们没有使用融合蛋白穿透细胞，但是一旦它们进入细胞，它们就会使周围的所有细胞迅速融合。 他用自己的职业生涯来表征这类与融合相关的
跨膜蛋白 ，该
蛋白比其他病毒表达的最小融合蛋白小两个数量级，但足以引发细胞，最重要的是脂质纳米颗粒与细胞的融合。
当将这些蛋白质包含在基于中性脂质纳米颗粒的平台中时，您会发现仅中性脂质在传递负荷方面极差。 在我们的示例中，我们使用了针对癌细胞的
mCherry质粒，因此，没有融合蛋白根本无法递送，有了它们，我们就可以实现出色的递送。 因此，它们使中性脂质颗粒的递送增加了80-350倍，并且
在体内具有良好的耐受性。 在
萤光素酶的实验中
，我们将表达萤光素酶的mRNA注入尾静脉。 我们在体内获得萤光素酶表达。 我们注意到在肺和肝中有积累，但是我们在许多组织（包括皮肤和全身的软组织）中都有良好的表达。
我们使用我们的平台为衰老细胞提供有效载荷。 该平台称为
Fusogenix 。 它使用无毒且具有良好耐受性的中性脂质纳米颗粒。 她使用这些融合蛋白进入细胞。 我不想研究所有小事情。 我们花了三年时间来创建针对这些蛋白质的抗体，但它们实际上是非免疫原性的。 其原因是它们大多数是跨膜结构域。 它们具有
亲脂性 ，因此它们将脂质包裹在自身周围，并且没有免疫原性。 我们花了很多时间来改善这些融合蛋白，使其变得更好。 我不会深入研究所有小事情，但是现在我们有了一个用于大量工业生产和
冻干的平台 ，我们可以根据要求发送它们。
让我向您展示在实验中获得的数据-他们将活化的p16 caspase-9导入小鼠体内。 在这种情况下，我们对16只小鼠进行了实验，这是80周龄的老年小鼠。 我们将它们分为三组，我们向他们介绍了没有二聚体或两种剂量（5和10 mg / kg-和10 mg / kg-这是大剂量）的对照LNP。 我们通过注射入尾静脉来治疗这些动物。 我们等待了96个小时，然后又通过静脉注射了二聚体。 然后，我们又等了两天，收集了组织，血液，进行了敏感的
RT-PCR ，并用几种基因对其进行了控制。 我们在各种组织中收到令人信服的剂量依赖性p16表达下降。
我将向您展示几张图像，其中我们花费了大量时间优化小鼠的β-gal染色。 这些是我们拥有的最好的图像，但是在几个组织中，β-半乳糖苷酶的表达呈剂量依赖性降低。 非常令人鼓舞的信息。 当然，在实验室工作是好的，但是如果我们要将其翻译成人们，有很多事情需要澄清。 毒理学极为重要。 这对于您要循环执行的药物很重要，以确保您的身体不会形成中和抗体。 因此，我们对重复剂量进行了许多研究，并且没有记录任何抗体，因此我们可以重复剂量给予它而不会降低效力。 CARPA是我最近了解到的一种
互补激活的伪过敏症 ，是许多接受纳米颗粒疗法（例如
多西尔）的患者可能具有的免疫反应。 我们进行了所有分析，并且它们的结果比多昔尔低，因此耐受性非常好。
我很高兴地说，我们对灵长类动物进行了一些初步研究，我们给它们施用了人类最大10倍的剂量，并且耐受性非常好。 这些猴子实际上分别接受了p53和p16的治疗，同时接受了二聚体的治疗，因此我们依靠的是良好的数据。 现在我们正在研究它们。
这些颗粒的耐受性非常重要。 我正在显示此幻灯片，因为它显示了脂质纳米颗粒临床试验中所做的所有努力及其失败的原因。 如果您看一下前三个程序，它们在十年前使用阳离子
脂质体和脂质纳米颗粒是有前途的。 您可以看到它们的最大耐受剂量小于1 mg / kg，并且这些程序均由于肝脏毒性而失败。 第二代，有条件的阳离子脂质，或多或少地被转移了，其中一些程序是成功的，将导致药物的批准，但所有目标都是肝脏。 由于脂质纳米颗粒在肝脏中积累，如果您不使用中性脂质组合物，您将看到剂量限制性毒性。 然后，您可以看到使用像我们这样的中性脂质组合物的工作，而他们在一项研究中找不到最大耐受剂量。 根据我们对非人类灵长类动物的研究，我们期望我们的颗粒具有相同的耐受性。
我们目前正在评估各种构建体，以找出哪种构建体最适合人类使用，并且在本次会议上我们显然谈到了这一点-创建可作为临床试验良好指标的生物标志物以及用于评估有效性的动物模型。 我们真的很想与任何具有良好生物标记的科学家交谈。 我们有几组小鼠，研究这些小鼠的寿命和健康状况。 当我们进行
GMP和
GLP毒性分析时，我们正在考虑进入临床阶段。
因此，我将转向癌症，因为这是我们前往诊所的主要途径。 我的主要工作是研究
前列腺癌 。 衰老与癌症之间的联系真正使我着迷的是p53途径的激活。 p53基因是癌症中突变最严重的基因，有许多类型的癌症在p53中具有很高的突变负荷。 我之所以选择前列腺癌，是因为它的发病率很低，平均占前列腺癌的10％，大多数前列腺癌的活动能力很低。
一旦您转移了疾病，这种突变率就会超过50％。因此，这是治疗癌症的好目标。尽管p53蛋白本身尚未成为癌症治疗的靶标，但我相信它们非常有前途。在p53中，您可以获得两种类型的突变。在细胞复制或突变过程中，它们激活p53修复损伤或发生凋亡。因此，细胞要么发生突变，要么摆脱p53以绕过它。结果，实际的激活路径受到非常严格的控制。那么这种激活作用可以用来杀死癌细胞吗？in vitro , , in vivo , . , . p53, iCas9, . . NOD/SCID . 500 3 . , , . , 90-95% 48 – , , , , .
真正的证明是进行全身注射的能力，我们进行了这些研究。这只是该组中四只小鼠的一个例子。我们长出了这些非常大的肿瘤，将它们长到了500 mm 3。在这种情况下，我们每天向尾静脉注射四次LNP，在第五天系统地给他们一剂二聚体。再次，我们看到了显着的结果：在短短两天内肿瘤减少了50-98％。这些动物单次注射后导致存活率显着增加。平均而言，每组六只小鼠的肿瘤体积减少了近70％。, : . , , . , . , , LNP ,
. .
. , Oisin , . , , , , . , I / IIb , GLP, . 2019 . . : , . I , , , , . , , II.